Genetic diversity analysis of four Cyprininae fish species in South China based on mitochondrial DNA D-loop sequence
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摘要:目的
研究华南地区鲤亚科鱼类的遗传多样性，为开展淡水鱼类的遗传育种工作提供参考。
方法本研究采集位于海南省、广东省、广西壮族自治区的华南鲤（Cyprinus carpiorubrofuscus Lacepede）、尖鳍鲤（Cyprinus acutidorsalis Wang）、三角鲤（Cyprinus multitaeniata Pellegrin et Chevey）和须鲫（Carassioides cantonensis Heincke）4种鲤亚科鱼类的6个种群共156个样本，采用线粒体D-loop标记分析其遗传多样性。
结果研究结果表明，华南鲤的海南、珠江和榕江3个种群的遗传多样性相对较高，其线粒体控制区的单倍型多样性分别为0.814、0.895和0.879；须鲫、尖鳍鲤和三角鲤的单倍型多样性较低，分别为0.748、0.794和0.536。华南鲤的遗传多样性较高，其中海南种群略低于珠江种群和榕江种群，可能与历史上的冰期活动和琼州海峡的阻隔有关。须鲫、尖鳍鲤和三角鲤三者的遗传多样性相对较低，这可能与3个物种本身的分布范围较小、生存能力较差有关。
意义本研究结果为进一步探明华南地区鲤亚科鱼类的自然资源状况和开展淡水鱼类的遗传育种工作提供了重要的参考。
Abstract:ObjectiveThis study aims to analysis the genetic diversity of Cyprinidae in South China, and provide reference for genetic breeding of freshwater fish.
MethodsThe genetic diversity of Cyprininae fish in South China, a total of 156 samples from six populations of four species of Cyprininae fish, including Cyprinus carpiorubrofuscus Lacepede, Cyprinus acutidorsalis Wang, Cyprinus multitaeniata Pellegrin et Cheveyand, Carassioides cantonensis Heincke, were collected in Hainan Province, Guangdong Province, and Guangxi Zhuang Autonomous Region. The mitochondrial D-loop marker was used to analyze genetic diversity.
ResultsThis study showed that the genetic diversities of Cyprinus carpio rubrofuscus Lacepede had higher genetic diversity. In which, the haplotype diversities based on D-loop were 0.814, 0.895 and 0.879, respectively. The haplotype diversities of Carassioides cantonensis Heincke, Cyprinus acutidorsalis Wang and Cyprinus multitaeniata Pellegrin et Chevey based on D-loop were in lower levels, which were 0.748, 0.794 and 0.536, respectively. Among which, the genetic diversity of Hainan population was lower a bit than that of the Pearl River population and Rongjiang population. This may be caused by the Ice Age and the separation of Qiongzhou Strait. The genetic diversities of Carassioides cantonensis Heincke, Cyprinus acutidorsalis Wang and Cyprinus multitaeniata Pellegrin et Chevey were in very low levels, which were related with their small distributions and low viabilities. This study found that Cyprinus acutidorsalis Wang, Cyprinus multitaeniata Pellegrin et Chevey, and Carassioides cantonensis Heincke did not share any haplotypes, indicating that there was no recent population exchange among these three taxa and suggesting significant population differentiation. Additionally, Cyprinus multitaeniata Pellegrin et Chevey and Carassioides cantonensis Heincke did not share haplotypes with Cyprinus carpiorubrofuscus Lacepede, indicating that there was no recent genetic exchange between these two taxa and Cyprinus multitaeniata Pellegrin et Chevey and Carassioides cantonensis Heincke have been separated from the population of Cyprinus carpiorubrofuscus Lacepede for a relatively long period of time.
SignificanceThis research provides important insights into the natural resource status of Cyprinidae fish in South China and offers a reference for future conservation and genetic breeding.
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华南地区位于中国最南部，包括广东省、广西壮族自治区、海南省、香港特别行政区和澳门特别行政区，该地区雨热充足、生物多样性较高、水系较多，是中国重要的渔业种质资源宝库。鲤亚科（Cyprininae）鱼类在鱼类分类学中属于鲤形目（Cypriniformes）、鲤科（Cyprinidae）。根据《中国鲤科鱼类志》，中国鲤亚科鱼类一共有5个属，分别是鲃鲤属（Puntioplites Smith）、原鲤属（Procypris Lin）、鲤属（Cyprinus Linnaeus）、须鲫属（Carassioides Ōshima）和鲫属（Carassius Jarocki）。其中鲤属、原鲤属、须鲫属和鲫属在华南地区均有分布[1]。华南鲤（Cyprinus carpiorubrofuscus Lacepede）是鲤（Cyprinus carpio Linnaeus）的一个亚种，分类上属于鲤属、鲤亚属，其外形与鲤相似，只是在侧线鳞和背鳍条等可数形状上有一定的差异[1-3]。三角鲤（Cyprinus multitaeniata Pellegrin et Chevey）按照伍献文[1]的分类应归类为鲤属、中鲤亚属（Mesocyprinus Fang），又名芝麻鲫、黄板鲫、黄鲫和江鲫，其分布范围很小，主要分布于中国珠江水系支流的西江流域，且主要分布在广西[4-8]。须鲫（Carassioides cantonensis Heincke）属于鲤亚科须鲫属，又名黄鲫、江鲫，据报道在中国珠江流域和海南岛有分布[1]。目前已知须鲫分布范围小，且相关文献很少，2013年有研究报道，在中国云南地区有须鲫的发现[9] 。尖鳍鲤（Cyprinus acutidorsalis Wang）分类上为鲤属、鲤亚属，又名海鲤、海鲫，是中国特有的生活于咸淡水中的鲤科鱼类，主要分布于广西和海南的少数江河出海口[2-3]；其体高较高，背鳍隆起，之后急剧下降，形成尖端突起的背鳍，因此得名尖鳍鲤[10-13]。
朱华平等[14]采用16对微卫星引物对华南鲤第5代选育群体（F5）和2个地方品种（乳源群体、乐昌群体）的遗传多样性进行比较分析；邓春兴等[15]基于线粒体控制区序列对海南须鲫进行遗传多样性分析，发现海南须鲫万泉河和南渡江群体的单倍型多样性分别为0.676 2、0.699 3；王超等[16]对钦州尖鳍鲤遗传多样性进行分析，其线粒体单倍型多样性为0.911。目前关于华南鲤、尖鳍鲤、三角鲤和须鲫遗传多样性的研究不多，尤其是对野外资源的研究更少，样本量也偏低，且未见其他关于三角鲤、华南鲤野生种群遗传多样性的研究。因此，本研究基于线粒体D-loop标记分析华南地区4种鲤亚科鱼类（华南鲤、尖鳍鲤、三角鲤和须鲫）6个种群的遗传多样性，旨在进一步探明华南地区鲤亚科鱼类自然资源状况，为开展淡水鱼类的遗传育种工作提供参考。
1. 材料与方法
1.1 仪器
超净工作台；立式电热压力蒸汽灭菌器；超纯水系统；PCR仪；RDY-SPIZ琼脂糖水平电泳仪；小型高速冷冻离心机；涡旋震荡器；电热恒温水浴锅；ALPHA IMAGER
2200 凝胶成像分析系统；−80 ℃超低温冰箱；−20 ℃冰箱；电子分析天平；微量移液器等。1.2 实验试剂与试剂盒
无水乙醇、75%乙醇、去离子水、双蒸水、琼脂糖、TIANGEN蛋白酶K（20 mg/mL）、Tris平衡酚、苯酚、氯仿、异戊醇、核酸染色剂EB（溴化乙锭）、6×Loading buffer上样缓冲液，DL2000 DNA marker、TIANGEN DNA提取试剂盒、TIANGEN普通琼脂凝胶DNA回收试剂盒、2×Taq PCR Master Mix、50×TAE电泳缓冲液、1×TAE电泳缓冲液、组织细胞裂解液、EDTA缓冲液（pH 8.0）等。
1.3 样品采集与处理
如表1所示，本研究共采集位于海南省、广东省、广西壮族自治区的华南鲤、尖鳍鲤、三角鲤和须鲫4种鲤亚科鱼类6个种群，合计156个样本。其中，华南鲤万泉河种群21个，采集地为海南省琼海市，以下简称海南鲤，英文缩写HL；华南鲤珠江种群31个，采集地为广东省肇庆市，以下简称珠江鲤，英文缩写ZL；华南鲤榕江种群22个，采集地为广东省汕头市，以下简称榕江鲤，英文缩写RL；尖鳍鲤钦江种群37个，采集地点为广西钦州市，以下简称尖鳍鲤，英文缩写GJ；须鲫万泉河种群21个，采集地为海南省琼海市，以下简称须鲫，英文缩写XJ；三角鲤珠江种群24个，采集地点为广西南宁，以下简称三角鲤，英文缩写SJ。将采集的鱼取约0.5~1.5 g鳍条或者肌肉组织，放置于装有无水乙醇的5 mL离心管中保存待测。本研究遵守华南农业大学伦理审查委员会规范，样品采集符合实验动物福利要求。
表 1 样品采集地点和种类Table 1. Sample collection location and type物种
Species种群
Populations样本量
Sample sizes中文简称
Chinese abbreviation缩写
Abbreviation采集地
Collection sites华南鲤Cyprinus carpiorubrofuscus Lacepede 华南鲤海南万泉河种群 21 海南鲤 HL 海南省琼海市 华南鲤珠江种群 31 珠江鲤 ZL 广东省肇庆市 华南鲤榕江种群 22 榕江鲤 RL 广东省汕头市 尖鳍鲤Cyprinus acutidorsalis Wang 尖鳍鲤钦江种群 37 尖鳍鲤 GJ 广西壮族自治区钦州市 须鲫Carassioides cantonensis Heincke 须鲫万泉河种群 21 须鲫 XJ 海南省琼海市 三角鲤Cyprinus multitaeniata Pellegrin et Chevey 三角鲤珠江种群 24 三角鲤 SJ 广西壮族自治区南宁市 1.4 DNA提取和检测
1.4.1 提取
本研究DNA提取分为2种，分别为自配试剂提取和试剂盒提取。
1）试剂盒提取：按照TIANGEN试剂盒说明书操作。
1.4.2 检测
取2 µL已提取的DNA样品液并加入1 µL 6×Loading buffer上样缓冲液混匀，用移液枪逐个加入凝胶点样孔中，同时保留一孔点上DL2000 DNA Marker，设置电压120 V进行恒定电压电泳，定时30 min，取出凝胶并放入凝胶成像系统，打开电脑软件进行观察，拍照并记录DNA提取情况。
2）自配试剂提取法
（1）取保存于无水乙醇的样品约80~100 mg，用去离子水冲洗一遍，再放入装有去离子水的烧杯漂洗2 min，用滤纸吸干后置于1.5 mL离心管内。
（2）先加入50 µL裂解液，用剪刀碎组织样品，后再加入450 µL裂解液和10 µL蛋白酶K用涡旋振荡器混合20 s，置于水浴锅中55 ℃恒温裂解3~7 h，根据裂解效果而定。
（3）加入500 µLTris平衡酚，涡旋振荡器混合20 s后，置于离心机12 000 r/min离心8 min。
（4）重新取离心管并标号，每管用移液枪加入对应管的上清液，后加入等体积苯酚∶氯仿∶异戊醇混合液，涡旋振荡器混合15 s后，置于离心机中12 000 r/min离心8 min。
（5）离心后用移液枪取上清液于已经标号的新离心管中，加入等体积的氯仿，涡旋振荡器混合15 s后，置于离心机中
12000 r/min离心8 min。（6）取新离心管进行标号，加入上清液，再加入等于上清液2倍体积的无水乙醇（−20 ℃），于冰箱中−20 ℃放置2 h后，12 000 r/min离心10 min。
（7）去除上清液，每管加入600 µL 75%乙醇（−20 ℃）漂洗，轻轻敲打，让底部白色沉淀悬浮于酒精中后，放入离心机中
12000 r/min中离心10 min，离心后取出上清液后，通风晾干约15~20 min。（8）加入75 µL TE缓冲液，放置于−20 ℃冰箱保存待用。
1.5 引物设计和PCR扩增
本研究根据已报道的鲤科目鱼类相关序列，线粒体控制区D-loop序列引物采用2对引物：三角鲤和华南鲤D-loop序列采用DL1：5c-ACCCCTGGCTCCCAAAGC-3c，DL2：5c-ATCTTAGCATCTTCAGTG-3c；尖鳍鲤和须鲫D-loop序列采用D-loop pro: 5c-TCCCAAAGCTAGGATTCTAAACTAAAC-3c，D-loop pre: 5c-TTCATCTTAACATCTTCAGTGTTATGC-3c。
线粒体D-loop序列引物DL1/DL2的PCR扩增程序：94.0 ℃预变性3 min；94.0 ℃变性40 s，57.0 ℃退火45 s，72.0 ℃延伸1 min，35个循环；最后72.0 ℃延伸10 min，4 ℃保存。
线粒体D-loop序列引物D-loop pro/D-loop pre的PCR扩增程序：94.0 ℃预变性3 min；94.0 ℃变性45 s，56.0 ℃退火30 s，72.0 ℃延伸1 min 10 s，35个循环；最后72.0 ℃延伸10 min，4 ℃保存。
PCR反应体系体积为50 µL，各反应物添加量如表2所示。
表 2 PCR扩增体系Table 2. PCR amplification system反应物 Reactant substances 体积/μL Volume Buffer缓冲液（含Mg+） 5 dNTPs 5（各2.5 mmol/L） Taq酶 Taq enzyme 0.5（2 U） 上游引物 Upstream primer 1（20 µmol/L） 下游引物 Downstream primer 1（20 µmol/L） 模板DNA Template DNA 2（约为100 ng） 无菌双蒸水Sterile double distilled water 35.5 合计 Total 50 1.6 DNA序列测定
将PCR所得产物直接进行琼脂糖凝胶电泳检测，将电泳检测获得目的条带的PCR产物送往上海美吉生物医药科技有限公司广州测序部进行DNA序列测序。
1.7 数据处理
采用Chromas软件查看序列的测序效果，并以此为依据判断测序是否准确。使用MEGA 6.06软件的ClustalW功能进行序列比对，并进行人工矫正，去除受干扰序列片段后，计算碱基组成比例、平均碱基数、简约信息位点等数值。使用DNASP软件进行中性假说检验（Fu’s Fs-test和Tajima’s D算法）和核苷酸分析，并计算平均核苷酸差异值和核苷酸多样性。使用Allequin V3.5.1.3软件分析单倍型多样性和单倍型组成等。
2. 结果与分析
2.1 线粒体D-loop序列结构和变异
三角鲤和华南鲤D-loop序列用引物DL1/DL2扩增获得多条带，尖鳍鲤和须鲫的D-loop标记用引物D-loop pro/D-loop pre扩增获得了清晰条带。
本研究共获得了156个个体的线粒体控制区序列，其中海南鲤21个、珠江鲤31个、榕江鲤22个、须鲫21个、尖鳍鲤37个、三角鲤24个。经过序列比对和处理后，线粒体控制区序列的平均碱基个数：海南鲤727.19、珠江鲤727.45、榕江鲤727.23、尖鳍鲤727.03、须鲫727.95、三角鲤731.04。
在所有控制区序列中，碱基T、C、A、G的平均含量分别为35.18%±0.60%、18.93%±0.58%、32.30%±0.40%、13.59%±0.07%，其中A+T含量（67.48%±0.57%）大于C+G（32.52%±0.57%）（表3）。
表 3 各种群线粒体控制区序列的碱基组成比例Table 3. The base composition ratio of mitochondrial control region sequences in various populations种群
Populations碱基含量/% Base content 碱基数/bp
Alkali baseT C A G A+T C+G HL 35.47 18.89 31.92 13.72 67.40 32.60 727.19 ZL 35.40 18.91 32.14 13.56 67.54 32.46 727.45 RL 35.42 18.89 32.11 13.58 67.53 32.47 727.23 GJ 35.38 18.96 32.06 13.59 67.45 32.55 727.03 XJ 33.96 19.88 32.63 13.53 66.59 33.41 727.95 SJ 35.43 18.05 32.96 13.57 68.38 31.62 731.04 平均值±标准差
Mean±SD35.18±0.60 18.93±0.58 32.30±0.40 13.59±0.07 67.48±0.57 32.52±0.57 727.98±1.53 2.2 基于线粒体D-loop序列的遗传多样性分析
根据表4所示，6个种群的156个线粒体控制区序列中，总样本间的简约信息位点为115个，平均核苷酸差异值为28.527，核苷酸多样性为
0.03946 ，单倍型个数为48个，单倍型多样性为0.956。在简约信息位点数目中，珠江鲤最高，为21个；其次依次为榕江鲤、海南鲤、尖鳍鲤和三角鲤，分别为20个、13个、9个和7个；须鲫最少，为4个。在6个种群中，榕江鲤的核苷酸多样性差异数最大，为0.01013 ，其次是珠江鲤（0.00996 ）、海南鲤（0.00695 ）、尖鳍鲤（0.00244 ）、须鲫（0.00186 ）和三角鲤（0.00206 ）。在单倍型多样性中，珠江鲤（0.895）最高，其次为榕江鲤（0.879）、海南鲤（0.814）、尖鳍鲤（0.794）、须鲫（0.748）和三角鲤（0.536）。在单倍型多样性中，珠江鲤（0.895）最高，其次分别为榕江鲤（0.879）、海南鲤（0.814）、尖鳍鲤（0.794）、须鲫（0.748）和三角鲤（0.536）。上述指标表明，珠江鲤、榕江鲤和海南鲤3个鲤群体的线粒体控制区的多样性较高，而尖鳍鲤、须鲫和三角鲤的遗传变异较少。表 4 线粒体控制区序列位点信息和多样性分析Table 4. Information and diversity analysis of mitochondrial control region sequence loci种群
Populations样本
数量
n简约信息
位点
Pi平均核苷酸
差异值
k核苷酸
多样性
π单倍型
多样性
Hd单倍型（数量）
Haplotype (number)HL 21 13 5.029 0.00695 0.814 Ha1（2）、Ha2（1）、Ha3（7）、Ha4（1）、Ha5（2）、Ha6（6）、Ha7（2） ZL 31 21 7.234 0.00996 0.895 Ha1（1）、Ha3（1）、Ha4（1）、Ha5（1）、Ha7（1）、Ha8（8）、Ha9（5）、Ha12（1）、Ha17（1）、Ha18（3）、Ha19（1）、Ha20（1）、Ha21（1）、Ha22（1）、Ha23（1）、Ha24（1）、Ha25（1）、Ha26（1） RL 22 20 7.364 0.01013 0.879 Ha5（4）、Ha8（4）、Ha9（6）、Ha10（2）、Ha11（1）、Ha12（1）、Ha13（1）、Ha14（1）、Ha15（1）、Ha16（1） GJ 21 9 1.772 0.00244 0.794 Ha1（1）、Ha3（1）、Ha27（13）、Ha28（11）、Ha29（1）、Ha30（3）、Ha31（1）、Ha32（1）、Ha33（2）、Ha34（1）、Ha35（1）、Ha36（1） XJ 37 4 1.352 0.00186 0.748 Ha37（9）、Ha38（2）、Ha39（4）、Ha40（1）、Ha41（2）、Ha42（1）、Ha43（1）、Ha44（1） SJ 24 7 1.507 0.00206 0.536 Ha45（16）、Ha46（2）、Ha47（4）、Ha48（2） 所有种群
All populations156 115 28.527 0.03946 0.956 — 注：n为样本数量；Pi为简约信息位点；k为平均核苷酸差异值；π为核苷酸多样性；Hd为单倍型多样性。 Notes: n represents the number of samples; Pi represents the reduced information site; k represents the average nucleotide difference; π represents nucleotide diversity; Hd represents haplotype diversity. 在数据分析过程中，由于156个线粒体控制区序列中单倍型数量较多，且3个鲤群体和尖鳍鲤、三角鲤之间没有共同单倍型，因此本研究将3个华南鲤群体之间单独进行单倍型比较。
在海南鲤、珠江鲤和榕江鲤3个群体的线粒体控制区序列中，只有1种共同单倍型（Ha5）。除Ha5单倍型外，珠江鲤分别与海南鲤、榕江鲤有4种、3种共同单倍型，其中珠江鲤和海南鲤两者的共同单倍型为Ha1、Ha3、Ha4和Ha7；珠江鲤和榕江鲤的共同单倍型为Ha8、Ha9和Ha12。海南鲤共有7种单倍型，其中只有Ha2和Ha6是特有单倍型。珠江鲤有18种单倍型，其中有10种特有单倍型，为Ha17~ Ha26。而尖鳍鲤和海南鲤、珠江鲤有2种共同单倍型，分别是Ha1和Ha3，但须鲫、尖鳍鲤和三角鲤之间没有共同单倍型，说明这3个群体之间具有较大的遗传分化。其中尖鳍鲤有12种单倍型，须鲫有8种单倍型，而三角鲤只有4种单倍型。
2.3 种群动态分析和中性检验
由表5可知，珠江鲤和榕江鲤的种内遗传距离最大，其线粒体控制区的遗传距离分别达到了
0.0104 、0.0103 ，而海南鲤相对较低，为0.0070 ；须鲫、尖鳍鲤和三角鲤分别为0.0026 、0.0025 和0.0021 ，说明三者的内部遗传差异很小。基于线粒体控制区序列的中性检测，种群内和种群间的Tajima’s D和Fu’s Fs statistic值不具有显著的差异性，说明群体间的线粒体控制区序列变异较大，尚不能证明符合中性假说。表 5 中性检验、Kimura双参数模型遗传距离和标准差结果Table 5. Neutral test, Kimura two-parameter model genetic distance and standard deviation results种群
Populations遗传距离
d标准差
SDTajima’s D Fu’s Fs statistic HL 0.007 0 0.0019 0.4801 1.825 ZL 0.0104 0.002 0 − 0.5436 −2.893 RL 0.0103 0.0022 1.0388 0.798 XJ 0.0026 0.0009 − 0.5939 −2.357 GJ 0.0025 0.0008 − 1.5102 −5.420 SJ 0.0021 0.0008 − 0.6124 1.233 所有种群
All populations— — 0.6328 1.955 注：Tajima’s D和Fu’s Fs statistic值中，P<0.05为显著，标注*；P>0.05为不显著，不标注。 Notes: In Tajima’s D and Fu’s Fs statistical values, P<0.05 is signifi-cant, marked with *; P>0.05 is not significant and is not labeled. 3. 讨论
3.1 华南地区4种鲤亚科鱼类种群的遗传多样性
有研究认为核苷酸多样性低于
0.0047 则认为多样性较低[17]，本研究基于线粒体控制区的核苷酸多样性结果，表明3个华南鲤种群核苷酸多样性均高于0.0047 ，而须鲫、尖鳍鲤和三角鲤的核苷酸多样性均低于0.0047 ，说明华南鲤的遗传多样性较高，而须鲫、尖鳍鲤和三角鲤的遗传多样性较低。本研究表明海南鲤、珠江鲤和榕江鲤种群基于线粒体控制区的单倍型多样性都较高且差异不大，分别为0.814、0.895和0.879，而核苷酸多样性珠江鲤（0.00996 ）和榕江鲤（0.01013 ）则明显高于海南鲤（0.00695 ），说明海南鲤虽然具备较高的单倍型多样性，但是没有足够的时间积累核苷酸多样性，单倍型之间的核苷酸差异小于珠江鲤和榕江鲤。由于淡水水系受地形制约作用明显，而海南岛自冰期以来和欧亚大陆一直处于隔绝状态，外来的鲤鱼种群在冰期后无法进入海南岛水系，且海南岛水系相对较小的种群容易受外界环境的破坏而经历瓶颈效应，从而导致种群数量恢复后遗传同质性较大。基于其中性检测的Tajima’s D和Fu’s Fs statistic值均未出现显著差异的负值[18]，说明如果海南种群经历瓶颈效应的历史比较久，单倍型多样性有所积累，但是核苷酸多样性积累还不够。而珠江和榕江属于大陆水系，洪水和河流改道等因素可以导致外来种群进入该水域，从而导致种群内部存在相对较大的核苷酸差异。须鲫、尖鳍鲤和三角鲤的基于线粒体控制区的单倍型多样性分别为0.748、0.794和0.536，而核苷酸多样性尤其低，仅为
0.00186 、0.00244 和0.00206 ，其多样性指标低于华南鲤的珠江、榕江和海南三个种群。王超等[16]基于线粒体控制区分析广西钦州茅尾海尖鳍鲤群体遗传多样性，得到尖鳍鲤的单倍型多样性为0.911，并认为该种群遗传多样性相对较低，保护尖鳍鲤种质资源刻不容缓；邓春兴等[15]基于线粒体控制区分析海南南渡江和万泉河2个水系须鲫的遗传多样性，得到万泉河和南渡江群体的单倍型多样性分别为0.6762 、0.6993 ，并认为海南须鲫遗传多样性低，亟待加强保护。目前尚未发现其他基于华南鲤和三角鲤野外种群的遗传多样性分析的研究。结合上述研究，本研究认为华南鲤、须鲫、尖鳍鲤和三角鲤的野生群体遗传多样性不容乐观。3.2 华南地区4种鲤亚科鱼类种群的亲缘关系
单倍型的组成可以很好地反映物种之间的种群交流，也是研究鱼类种群资源的重要指标之一[19-20 ]。3个华南鲤种群在线粒体控制区存在共同单倍型，其中3个种群的共同单倍型只有1个，而海南鲤和珠江鲤两者之间共同单倍型为5个，珠江鲤和榕江鲤两者之间的共同单倍型为4个，海南鲤与榕江鲤两者之间的共同单倍型只有1个，这也说明了珠江鲤遗传上可能与海南鲤更加接近，而海南鲤和榕江鲤的遗传差异较大。而尖鳍鲤有2个线粒体控制的单倍型和海南鲤、珠江鲤相同，基于Tajima’s D和Fu’s Fs statistic的中性检测值符合中性学说，说明群体内的简约位点和单点突变等多数突变是中性的，且近期并没有较大的自然选择压力。因此本研究认为出现共同单倍型的原因可能是尖鳍鲤和华南鲤之间差异位点不多，而多数简约信息位点都是华南鲤、尖鳍鲤共同拥有的，简约位点等多态位点的变异具有随机性，在一些简约位点上刚好出现相同的突变，从而导致出现一样的单倍型，这也可以合理地解释尖鳍鲤只有一个单倍型和华南鲤相同，出现率只有2/37；而基于这个事实可以认为，尖鳍鲤和华南鲤之间具有很近的亲缘关系。此外，本研究发现尖鳍鲤、三角鲤和须鲫三者没有出现共同单倍型，由此可见，三者之间在短期内没有出现种群交流，同时说明彼此间种群分化较大。而三角鲤、须鲫和华南鲤三者之间也没有共同单倍型，说明三角鲤和须鲫在较近的历史内没有和华南鲤有基因交流，且物种分离的历史比较久远。
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表 1 样品采集地点和种类
Table 1 Sample collection location and type
物种
Species种群
Populations样本量
Sample sizes中文简称
Chinese abbreviation缩写
Abbreviation采集地
Collection sites华南鲤Cyprinus carpiorubrofuscus Lacepede 华南鲤海南万泉河种群 21 海南鲤 HL 海南省琼海市 华南鲤珠江种群 31 珠江鲤 ZL 广东省肇庆市 华南鲤榕江种群 22 榕江鲤 RL 广东省汕头市 尖鳍鲤Cyprinus acutidorsalis Wang 尖鳍鲤钦江种群 37 尖鳍鲤 GJ 广西壮族自治区钦州市 须鲫Carassioides cantonensis Heincke 须鲫万泉河种群 21 须鲫 XJ 海南省琼海市 三角鲤Cyprinus multitaeniata Pellegrin et Chevey 三角鲤珠江种群 24 三角鲤 SJ 广西壮族自治区南宁市 
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表 2 PCR扩增体系
Table 2 PCR amplification system
反应物 Reactant substances 体积/μL Volume Buffer缓冲液（含Mg+） 5 dNTPs 5（各2.5 mmol/L） Taq酶 Taq enzyme 0.5（2 U） 上游引物 Upstream primer 1（20 µmol/L） 下游引物 Downstream primer 1（20 µmol/L） 模板DNA Template DNA 2（约为100 ng） 无菌双蒸水Sterile double distilled water 35.5 合计 Total 50
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表 3 各种群线粒体控制区序列的碱基组成比例
Table 3 The base composition ratio of mitochondrial control region sequences in various populations
种群
Populations碱基含量/% Base content 碱基数/bp
Alkali baseT C A G A+T C+G HL 35.47 18.89 31.92 13.72 67.40 32.60 727.19 ZL 35.40 18.91 32.14 13.56 67.54 32.46 727.45 RL 35.42 18.89 32.11 13.58 67.53 32.47 727.23 GJ 35.38 18.96 32.06 13.59 67.45 32.55 727.03 XJ 33.96 19.88 32.63 13.53 66.59 33.41 727.95 SJ 35.43 18.05 32.96 13.57 68.38 31.62 731.04 平均值±标准差
Mean±SD35.18±0.60 18.93±0.58 32.30±0.40 13.59±0.07 67.48±0.57 32.52±0.57 727.98±1.53
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表 4 线粒体控制区序列位点信息和多样性分析
Table 4 Information and diversity analysis of mitochondrial control region sequence loci
种群
Populations样本
数量
n简约信息
位点
Pi平均核苷酸
差异值
k核苷酸
多样性
π单倍型
多样性
Hd单倍型（数量）
Haplotype (number)HL 21 13 5.029 0.00695 0.814 Ha1（2）、Ha2（1）、Ha3（7）、Ha4（1）、Ha5（2）、Ha6（6）、Ha7（2） ZL 31 21 7.234 0.00996 0.895 Ha1（1）、Ha3（1）、Ha4（1）、Ha5（1）、Ha7（1）、Ha8（8）、Ha9（5）、Ha12（1）、Ha17（1）、Ha18（3）、Ha19（1）、Ha20（1）、Ha21（1）、Ha22（1）、Ha23（1）、Ha24（1）、Ha25（1）、Ha26（1） RL 22 20 7.364 0.01013 0.879 Ha5（4）、Ha8（4）、Ha9（6）、Ha10（2）、Ha11（1）、Ha12（1）、Ha13（1）、Ha14（1）、Ha15（1）、Ha16（1） GJ 21 9 1.772 0.00244 0.794 Ha1（1）、Ha3（1）、Ha27（13）、Ha28（11）、Ha29（1）、Ha30（3）、Ha31（1）、Ha32（1）、Ha33（2）、Ha34（1）、Ha35（1）、Ha36（1） XJ 37 4 1.352 0.00186 0.748 Ha37（9）、Ha38（2）、Ha39（4）、Ha40（1）、Ha41（2）、Ha42（1）、Ha43（1）、Ha44（1） SJ 24 7 1.507 0.00206 0.536 Ha45（16）、Ha46（2）、Ha47（4）、Ha48（2） 所有种群
All populations156 115 28.527 0.03946 0.956 — 注：n为样本数量；Pi为简约信息位点；k为平均核苷酸差异值；π为核苷酸多样性；Hd为单倍型多样性。 Notes: n represents the number of samples; Pi represents the reduced information site; k represents the average nucleotide difference; π represents nucleotide diversity; Hd represents haplotype diversity.
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表 5 中性检验、Kimura双参数模型遗传距离和标准差结果
Table 5 Neutral test, Kimura two-parameter model genetic distance and standard deviation results
种群
Populations遗传距离
d标准差
SDTajima’s D Fu’s Fs statistic HL 0.007 0 0.0019 0.4801 1.825 ZL 0.0104 0.002 0 − 0.5436 −2.893 RL 0.0103 0.0022 1.0388 0.798 XJ 0.0026 0.0009 − 0.5939 −2.357 GJ 0.0025 0.0008 − 1.5102 −5.420 SJ 0.0021 0.0008 − 0.6124 1.233 所有种群
All populations— — 0.6328 1.955 注：Tajima’s D和Fu’s Fs statistic值中，P<0.05为显著，标注*；P>0.05为不显著，不标注。 Notes: In Tajima’s D and Fu’s Fs statistical values, P<0.05 is signifi-cant, marked with *; P>0.05 is not significant and is not labeled.
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