马口鱼（Opsariichthys bidens）隶属于鲤形目（Cypriniformes）、鲤科（Cyprinidae）、鿕亚科（Danioninae）、马口鱼属（Opsariichthys），在南起海南岛、元江（红河），北至黑龙江流域的中国东部（台湾岛除外）的各江河均有分布^[1]。马口鱼多生活于山谷溪涧中，性凶猛，常捕食小鱼、小虾和水生昆虫，肉味鲜美，为山区群众日常食用的经济鱼类之一^[2]。近年来，由于受人类活动如过度捕捞、环境污染等影响，马口鱼自然资源急剧下降^[3]。目前，马口鱼的全人工繁育和养殖技术已经获得突破，在南方山区已经形成成熟的马口鱼养殖产业，市场前景广阔^[4-5]。而通过线粒体基因序列开展遗传结构和遗传多样性研究，对马口鱼种群的保护与良种选育具有重要意义^[6]。

线粒体DNA（Mitochondrionmt DNA，mtDNA）是长度为15~20 kb的环状DNA，具有分子量小、遗传自主性、进化速率快、母系遗传等特点，是一种重要的分子标记^[7-8]。mtDNA中细胞色素b（Cytochrome b，Cyt b）是研究较多的编码蛋白质的区域之一，进化速率一般；mtDNA控制区（Control region displacement loop，D-loop）为不编码的多变区，进化速率较mtDNA其他区段快，与Cyt b在进化上存在差别^[8-9]。因此，mtDNA中D-loop区和Cyt b常作为分子标记，被广泛用于鱼类的遗传多样性分析^[10-12]。目前，关于马口鱼mtDNA的研究，主要集中在其物种有效性及系统发育关系的探讨上^[13-15]，以及马口鱼属的迁移历史推测上^[16-17]。而有关马口鱼种群的遗传多样性研究相对较少，仅见于基于线粒体Cyt b基因对长江及其以南水系^[18]、伊洛河^[19]、钱塘江和瓯江^[6]等马口鱼群体的遗传多样性分析。基于D-loop区序列的马口鱼种群遗传多样性鲜有研究，但该序列在其他鱼类的种群遗传多样性应用研究较多，如李文俊等^[20]基于mtDNA控制区序列的珠江和长江水系光倒刺鲃（Spinibarbus hollandi）群体遗传变异分析；吴俊颉等^[21]基于线粒体D-loop区的抚仙湖鱇浪白鱼（Anabarilius graham）遗传多样性分析。据此，本研究拟采用mtDNA中Cyt b基因和D-loop区序列对牡丹江、闽江（含建溪和富屯溪）、汀江和南渡江马口鱼群体遗传多样性进行分析和评估，旨在从分子水平上丰富中国马口鱼群体遗传多样性数据库资源，为马口鱼的种质资源保护和保持选育群体的遗传多样性提供参考。

1.   材料与方法

1.1   样品与DNA提取

2022年，利用刺网共采集来自牡丹江（Mudanjiang，MDJ）、闽江富屯溪（Futunxi，FTX）、闽江建溪（Jianxi，JX）、汀江（Tingjiang，TJ）和南渡江（Nandujiang，NDJ）的马口鱼样品136尾。详细采样信息见表1。取鳍条组织置于无水乙醇中保存。马口鱼基因组DNA利用试剂盒（ TIANGEN DP304-02）进行提取，基因组DNA再经1%琼脂糖凝胶电泳检测，保存于−20 ℃备用。福建省淡水水产研究所实验管理和伦理委员会审批动物实验，批准编号为FFRIFJ-DW-2022-8。

表  1  各水系马口鱼群体的采集信息

Table  1.  Sampling informations of wild O. bidens collected from different basins

水系 Basins	采样地点 Sampling areas	体长/cm Body length	体质量/g Body mass	尾数 Number
牡丹江MDJ	黑龙江牡丹江（N44.06°、E128.96°）	10.0~17.3	13.5~88.9	30
富屯溪FTX	福建顺昌（N26.82°、E117.70°）	10.9~15.0	19.0~53.5	31
建溪JX	福建延平（N26.82°、E117.67°）	9.8~15.8	18.5~55.2	20
汀江TJ	福建龙岩（N25.35°、E116.35°）	11.0~17.1	22.3~97.8	24
南渡江NDJ	海南白沙（N19.20°、E109.49°）	6.0~13.1	3.5~41.7	31

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1.2   PCR扩增与序列测定

根据NCBI公布的马口鱼mtDNA全序列（GenBank：NC_008744），利用Primer Premier 6.0软件设计引物用于Cyt b基因和D-loop区序列扩增。本研究引物序列为Cyt b F：5’-AATGACTTGAAGAACCACCGT-3’ 、Cyt b R：5’-CAACGATCTCCGGTTTACAAGAC-3’ ；D-loop F：5’-AAAGCATCGGTCTTGTAATCCGAAG-3’ 、D-loop R：5’-CATGCGGAGTTTCTTAGGTC-3’ 。PCR反应体系20.0 μL，包含5×FastPfu Buffer 4.0 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL、Forward Primer （5.0 μmol/L）0.8 μL、FastPfu Polymerase 0.4 μL和Template DNA 10.0 ng，用ddH₂O补至20 μL。

扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，退火30 s，72℃延伸45 s，35个循环；72 ℃延伸10 min，10 ℃保存。

扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，送样测序。本研究引物合成、扩增及测序均由上海凌恩生物科技有限公司完成。

1.3   数据分析

为构建本研究马口鱼群体的Cyt b基因遗传进化树，用于比较分析的序列来自Li等^[15]公布的黑龙江阿穆尔河（Genbank：FJ602011）、吉林图们江（FJ601948）、辽宁辽河（FJ602015）、海南（FJ601961、FJ601976、FJ601989）和福建九龙江（FJ602005~FJ602009）Cyt b基因。利用BioEdit 7.0软件对测序结果进行人工校正比对，去除两端冗余序列。利用Mega 6.0软件计算碱基含量，并采用最大似然法（Maximum likelihood，ML）构建系统发育进化树，各分支置信度用Bootstrap重复检测1000次^[22]。运用DnaSP 5.0计算单倍型数目（Number of haplotypes，h）、单倍型多样性指数（Haplotypes diversity, H_d）、核苷酸多样性指数（Nucleotide diversity，π）、平均核苷酸差异数（Average number of nucleotide differences，K）和多态位点数目（Number of polymorphic sites，S）^[23]。使用Arlequin 3.5软件中的分子方差分析（Analysis of variance，AMOVA）法计算遗传分化指数（F-statistics，F_st）和进行中性检验，计算Tajima’s D和Fu’s F_s参数，据此推测马口鱼群体历史演化^[24]。

2.   结果与分析

2.1   马口鱼线粒体Cyt b基因和D-loop区序列及碱基组成

所有样品的测序结果经同源比对后，获得Cyt b基因序列102 6 bp，无插入或缺失，变异位点为165个，单倍型为35个，平均转颠换比值（TS / TV）为10，4种碱基A、T、G、C的平均含量分别为24.0%、29.5%、16.5%、30.0%，A+T含量53.5%高于G+C含量46.5%；获得D-loop序列928 bp，无插入或缺失，变异位点为80个，单倍型为37个，平均转颠换比值（TS / TV）为21，4种碱基A、T、G、C的平均含量分别为32.4%、33.4%、14.2%、20.0%，A+T含量65.8%高于G+C含量34.2%。两序列均出现明显的AT偏移，这符合已知鱼类线粒体DNA序列特征。

2.2   群体遗传多样性

马口鱼5个群体的136个样品中，基于Cyt b基因的单倍型数目（h）为35个，其中以MDJ群体最少（h = 1），NDJ群体最多（h =12）；单倍型多样性指数（H_d）为0.922，其中以MDJ群体最低（H_d = 0），TJ群体最高（H_d = 0.917）；核苷酸多样性指数（π）为0.05426，其中以MDJ群体最低（π = 0），TJ群体最高（π = 0.00462）；平均核苷酸差异数（K）为55.675 60，其中以MDJ群体最低（K = 0），TJ群体最高（K = 4.74275）（表2）。

表  2  马口鱼群体的遗传多样性

Table  2.  Genetic diversity of O. bidens based on the sequences of mtDNA Cyt b gene and D-loop region

基因Genes	群体Populations	S	h	π	Hd	K	Tajima’s D	Fu’s Fs
Cyt b	牡丹江MDJ	0	1	0	0	0	0	0
	富屯溪FTX	10	4	0.003 27	0.705	3.359 14	1.075 26	4.833 02
	建溪JX	14	9	0.003 47	0.858	3.563 16	−0.789 92	−1.263 89
	汀江TJ	18	10	0.004 62	0.917	4.742 75	−0.057 96	−0.426 43
	南渡江NDJ	34	12	0.003 22	0.875	3.217 74	−2.216 14*	−2.615 11
	全体	165	35	0.054 26	0.922	55.675 60	2.869 72	24.284 60
D-loop	牡丹江MDJ	2	2	0.000 99	0.460	0.919 54	1.682 64	3.114 77
	富屯溪FTX	3	2	0.000 59	0.181	0.541 94	−0.648 98	1.826 12
	建溪JX	6	5	0.001 11	0.505	1.026 32	−1.252 91	−1.048 09
	汀江TJ	59	16	0.028 74	0.957	26.615 90	2.673 93	1.615 69
	南渡江NDJ	58	20	0.028 50	0.974	26.387 10	3.051 24	1.005 54
	全体	80	37	0.028 24	0.875	26.148 80	2.512 51	5.012 10
注：S表示多态位点数目；h表示单倍型数目；π 表示核苷酸多样性指数；Hd表示单倍型多样性指数；K表示平均核苷酸差异数；*表示极显著（P<0.01）偏离中性检验模型。
Notes: S means number of polymorphic sites; h means haplotype quantity; π means nucleotide diversity; Hd means haploidtypes diversity; K means average number of nucleotide differences; * means extremely significant deviated from neutrality model (P<0.01).

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基于D-loop区序列的单倍型数目（h）为37个，其中以MDJ和FTX群体最少（h = 2），NDJ群体最多（h = 20）；单倍型多样性指数（H_d）为0.875，其中以FTX群体最低（H_d = 0.181），NDJ群体最高（H_d = 0.974）；核苷酸多样性指数（π）为0.028 24，其中以FTX群体最低（π =0.00059），TJ群体最高（π = 0.02874）；平均核苷酸差异数（K）为26.148 80，其中以FTX群体最低（K = 0.54194），TJ群体最高（K = 26.615 90）（表2）。

2.3   群体间遗传距离和遗传分化

各地理群体间遗传距离结果（表3）显示，基于Cyt b基因的5个群体间，以闽江流域的FTX和JX遗传距离最小（0.00304），MDJ和NDJ遗传距离最大（0.10311）。基于D-loop区序列的5个群体间，以FTX和JX遗传距离最小（0.00089），MDJ和TJ遗传距离最大（0.05153），其次为MDJ和NDJ（0.050 99）。

表  3  马口鱼群体的遗传距离和遗传分化指数

Table  3.  Estimate of genetic distance and fixation index among populations of O. bidens based on Cyt b gene and D-loop region

群体 Populations	牡丹江 MDJ	富屯溪 FTX	建溪 JX	汀江 TJ	南渡江 NDJ
牡丹江MDJ		0.949 99（0.971 91）	0.964 32（0.963 48）	0.935 03（0.719 22）	0.987 12（0.690 88）
富屯溪FTX	0.023 48（0.028 75）		0.275 23（0.053 47）	0.265 71（0.592 06）	0.974 15（0.553 58）
建溪JX	0.022 16（0.029 26）	0.003 04（0.000 89）		0.121 00（0.531 95）	0.974 21（0.500 30）
汀江TJ	0.022 37（0.051 53）	0.003 67（0.034 45）	0.003 16（0.034 58）		0.969 78（−0.033 96）
南渡江NDJ	0.103 11（0.050 99）	0.101 60（0.033 88）	0.101 90（0.034 28）	0.102 61（0.028 86）
注：对角线下方数值表示群体间遗传距离；对角线上方数值表示群体间遗传分化指数Fst；括号内数值为基于D-loop的计算结果。
Notes: The values of the genetic distance among populations are below the diagonal, the above diagonal values show the fixation index (Fst). The values in brackets are the results based on D-loop region.

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各地理群体间F_st结果（表3）显示，Cyt b基因以JX和TJ群体遗传分化程度最低（F_st = 0.12100），NDJ和MDJ遗传分化程度最高（F_st = 0.98712）。D-loop区序列以NDJ和TJ群体遗传分化程度最低（F_st = −0.03396），FTX和MDJ遗传分化程度最高（F_st = 0.97191）。

马口鱼群体间分子方差分析结果（表4）显示，基于Cyt b基因的群体间变异贡献率（96.00%）远高于群体内（4.00%）；基于D-loop区序列的群体间的群体间变异贡献率（62.23%）也高于群体内（37.77%）。这表明马口鱼群体间的遗传变异主要来自于群体间。

表  4  马口鱼群体Cyt b基因和D-loop序列遗传差异的分子方差分析（AMOVA）

Table  4.  Analysis of molecular variance（AMOVA）of O. bidens based on Cyt b gene and D-loop region

变异来源 Sources of variation	自由度 df	平方和 Sum of squares	变异组分 Variance component	变异贡献率/% Percentage of variation
群体间 Among populations	4（4）	3522.791（1055.551）	34.03328（9.55240）Va	96.00（62.23）
群体内 Within populations	126（131）	178.675（759.464）	1.41806（5.79743）Vb	4.00（37.77）
总计 Total	130（135）	3701.466（1815.015）	35.45133（15.34983）
注：括号内的数值为基于D-loop区序列的计算结果；Va和Vb分别表示群体间和群体内变异。
Notes: The values in brackets are the results based on the D-loop region. Va and Vb represent variance components among and within populations, respectively.

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2.4   单倍型分布和系统进化

在Cyt b基因的单倍型中，MDJ群体仅有1种单倍型；单倍型Hap4为闽江流域的FTX和JX所共有，其他水系间无共享单倍型（表5）。在D-loop区序列的单倍型中，Hap3是优势单倍型，为闽江流域的FTX和JX所共有；Hap6为JX和TJ所共有；Hap10、Hap13、Hap14、Hap15、Hap16和Hap22为TJ和NDJ所共有，其他单倍型为各水系独有（表5）。

表  5  马口鱼线粒体Cyt b基因和D-loop区序列单倍型分布

Table  5.  Haplotype distribution in O. bidens populations based on Cyt b gene and D-loop region

基因 Genes	群体 Populations	单倍型数 Haplotype no.	单倍型分布 Haplotypes distribution
Cyt b	牡丹江MDJ	1	Hap1(30)
	富屯溪FTX	4	Hap2(14), Hap3(3), Hap4(8), Hap5(6)
	建溪JX	9	Hap4(5), Hap6(6), Hap7(1), Hap8(1), Hap9(2), Hap10(2), Hap11(1), Hap12(1), Hap13(1)
	汀江TJ	10	Hap14(2), Hap15(4), Hap16(4), Hap17(1),Hap18(3), Hap19(3), Hap20(1), Hap21(2), Hap22(1), Hap23(3)
	南渡江NDJ	12	Hap24(8), Hap25(1), Hap26(5), Hap27(1), Hap28(1), Hap29(5), Hap30(1), Hap31(5), Hap32(1), Hap33(1), Hap34(1), Hap35(1)
D-loop	牡丹江MDJ	2	Hap1(10),Hap2(20)
	富屯溪FTX	2	Hap3(28),Hap4(3)
	建溪JX	5	Hap3(14), Hap5(3), Hap6(1), Hap7(1), Hap8(1)
	汀江TJ	16	Hap6(1), Hap9(2), Hap10(1), Hap11(1), Hap12(1), Hap13(1), Hap14(4), Hap15(3), Hap16(2), Hap17(2),Hap18(1)...Hap23(1)
	南渡江NDJ	20	Hap10(1), Hap13(1), Hap14(1), Hap15(2), Hap16(2), Hap22(2), Hap24(3), Hap25(2), Hap26(1), Hap27(1), Hap28(1), Hap29(2), Hap30(1), Hap31(1), Hap32(2), Hap33(1), Hap34(2), Hap35(1), Hap36(2)

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基于本研究5个群体线粒体Cyt b基因获得的35种单倍型，加上选取的GenBank中11种单倍型，对其采用最大似然法（ML）构建系统发育树（图1），显示46种单倍型大致分为3个分支：1大分支由（海南）南渡江（NDJ）群体的所有单倍型与海南（HN）3种单倍型构成；另1分支由牡丹江（MDJ）群体单倍型与东北河流阿穆尔河（Amur River）、图们江（Tumen River）、辽河（Liao River）群体单倍型组成；最后1分支由福建的富屯溪（FTX）、建溪（JX）、汀江（TJ）群体与九龙江（Jiulong River）构成。另外，东北河流与福建河流马口鱼群体单倍型先聚在一起，再与海南群体聚在一起，这与上述南渡江和其他群体间遗传距离相对较远（表3）相符。由此表明，福建马口鱼类群与东北马口鱼类群亲缘关系可能更近。

图  1  基于线粒体Cyt b基因的马口鱼群体单倍型系统进化树

注：■表示九龙江群体GenBank 登录号；▲表示辽河、图们江、阿穆尔河群体GenBank 登录号；●表示海南群体GenBank 登录号。

Figure  1.  The phylogenetic tree of O. bidens populations based on haplotypes of Cyt b gene

Notes: ■ represents GenBank ID of O. bidens populations in Jiulong River; ▲ represents GenBank ID of O. bidens popula-tions in Liao River, Tumen River and Amur River;● represents GenBank ID of O. bidens populations in Hainan.

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2.5   群体历史动态

基于Cyt b基因的5个群体中，MDJ群体为单一单倍型，不存在多态性，故Tajima’s D和Fu’s F_s值为0，不能进行核苷酸错配分析；FTX群体不存在显著性差异（P>0.05），且核苷酸错配图呈多峰（图2a），表明其历史上未发生过扩张。JX和TJ群体的Tajima’s D和Fu’s F_s值虽为负值，但其值不存在显著性差异（P>0.05），且核苷酸错配图呈多峰（图2b、图2c ），表明历史上未发生过种群扩张。NDJ群体的Tajima’s D和Fu’s F_s值为负值，Tajima’s D存在极显著差异（P<0.01），且核苷酸错配图呈单峰，表明南渡江群体历史上可能发生过种群扩张（图2d）。基于D-loop区序列的5个群体中，Tajima’s D和Fu’s F_s值均不存在显著性差异（P>0.05），群体核苷酸错配图也均呈多峰（图2e~图2i），这表明5个群体在历史上均未发生过种群扩张。

图  2  基于线粒体Cyt b基因和D-loop区序列的马口鱼核苷酸错配分布图

注：Cyt b（a. 富屯溪；b. 建溪；c. 汀江；d. 南渡江）; D-loop（e. 牡丹江；f. 富屯溪；g. 建溪；h. 汀江；i. 南渡江）。

Figure  2.  Mismatch distribution of O. bidens based on Cyt b gene and D-loop region

Notes: Cyt b (a. FTX; b. JX; c. TJ; d. NDJ); D-loop (e. MDJ; f. FTX; g. JX; h. TJ; i. NDJ).

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3.   讨论

3.1   遗传多样性

物种遗传多样性是长期进化的产物，能反映物种群体适应能力、生存能力和进化潜力，是评价种群资源状况和开展保护工作的重要基础与依据^{[12, 25]}。本研究的Cyt b基因和D-loop区序列的碱基含量A+T均高于G+C，而且D-loop区序列A+T含量高于Cyt b基因。这表现出mtDNA中碱基的偏倚性及其组成的不均一性，与硬骨鱼类线粒体基因的碱基组成一致^[26-27]。

根据Grant等^[28]评估物种遗传多样性高低的标准（H_d= 0.5，π=0.005）。本研究中，基于Cyt b基因的5个马口鱼群体，每个群体的单倍型多样性（H_d）和核苷酸多样性（π）均符合高H_d和低π类型，可能是这些种群经历了瓶颈效应或建群效应后扩张，同时又无充足时间去积累核苷酸变异；整体上，马口鱼群体符合高H_d和高π类型，与长江中上游、洞庭湖水系、鄱阳湖水系、东南沿海水系、珠江水系群体^[18]及钱塘江群体^[6]类型一致，表明马口鱼可能具有大而稳定的有效群体和较高的进化潜力，对环境变化有较强的响应能力^[18]。基于D-loop区序列，汀江和南渡江群体符合高H_d和高π类型，其可能是由一个大而稳定的种群经过长时间演化产生的；牡丹江和闽江（包括富屯溪和建溪）符合低H_d和低π类型，这些群体近期可能发生瓶颈效应或奠基者效应；整体上，5个群体符合高H_d和高π类型，与Cyt b基因所有群体类型是一致的。综上可以看出，中国马口鱼群体大而稳定，适应能力和生存能力强，但部分水系，如牡丹江和闽江群体可能近期发生了瓶颈效应或基础群体较小，应加强其保护力度和增加资源量，以提高其遗传多样性水平，防止马口鱼种质资源进一步衰退。

一般认为，线粒体基因组中D-loop区序列变异速率是高于Cyt b基因，更适用于种内或近缘种水平种群遗传结构及系统地理分析^[10-12]。本研究发现，整体上多态位点数（S）、核苷酸多样性指数（π）和单倍型多样性指数（H_d）均是D-loop区序列低于Cyt b基因（表2），这表明马口鱼D-loop区序列变异速率可能低于Cyt b基因，后者更适用于马口鱼种内或近缘种遗传结构及系统地理格局研究，这与赵亮等^[29]研究太湖新银鱼（Neosalanx taihuensis）的结果一致。

3.2   遗传分化

种群间的遗传距离和遗传分化指数是衡量种群多态性的重要指标^[6]。根据Shaklee等^[30]提出的鱼类遗传距离划分标准。本研究基于Cyt b基因的5个马口鱼群体中，除（海南）南渡江群体与其他群体分化达到种的划分标准（遗传距离大于0.05）外，其他群体的分化属于种群的水平，基于D-loop区序列的5个马口鱼群体中，所有群体间也属于种群的水平。有学者研究发现，遗传距离与群体间地理距离呈正相关，即地理距离越远，遗传距离越大^[31-32]。本研究中，南渡江与其他群体有琼州海峡阻隔，且地理距离较远，长期地理隔离可能造成了遗传距离较大；同属闽江流域的建溪和富屯溪群体地理距离最近，遗传距离也最小，这可能与两群体相互间基因交流较多、遗传分化程度较低有关。

根据Wright^[33]采用F_st作为衡量群体间遗传分化标准。本文基于Cyt b基因的群体间，仅有汀江和建溪群体间处于中等程度分化（F_st = 0.12100），而其他群体间遗传分化都很大。基于D-loop区序列的群体间，南渡江和汀江F_st为负值，说明两地理群体之间基因交流频繁；闽江的两个支流建溪和富屯溪群体处于中等程度分化，而其他群体间遗传分化很大。分子方差分析AMOVA结果显示，马口鱼群体间遗传变异贡献率高达96.00%（Cyt b）和62.23%（D-loop），说明群体间变异是马口鱼遗传变异的主要来源，这与群体间（除闽江的建溪和富屯溪外）长期的地理隔离限制了其基因交流有关。这与Perdices等^[13]对长江、珠江、海河3水系28个马口鱼群体和刘士力等^[6]对瓯江和钱塘江等2群体的研究结果一致（即群体间遗传分化达到显著水平，且遗传变异主要来源于群体间）。李文俊等^[20]在研究珠江和长江水系光倒刺鲃群体遗传分化中，也发现遗传变异主要来自各地理分组间，变异原因与长期的地理隔离有关。

综上所述，根据遗传距离和遗传分化标准，基于Cyt b基因的5个马口鱼群体可能分属2个种，也可从基于Cyt b基因构建的ML系统进化树形成的2个明显地理类群看出（图1），与Li等^[15]研究的中国马口鱼Cyt b隶属于2个分支，可分为2个种一致。但在群体间遗传距离和遗传分化程度上，马口鱼D-loop区序列均与Cyt b存在差异，这可能是mtDNA的Cyt b基因和D-loop区序列进化速度不同而导致的，这些结果有待通过分子系统研究并结合形态特征及解剖结构分析进一步论证^[34]。

3.3   群体进化

在单倍型进化关系中，基于Cyt b基因的单倍型结果（表5），牡丹江群体仅有1种单倍型且独有，但仍待进一步采集更多样品进行验证；富屯溪和建溪为闽江上游主要支流，河道虽有水坝（沙溪口电站）阻隔，但历史上还是相通的，故群体间遗传距离较近，具有共享单倍型（Hap 4）；其他单倍型为各自水系（或河流）独有，这是因为不同水系由于长期地理隔离，群体间缺乏基因交流，形成了明显的地理遗传结构，各自独立进化^[13]。

在D-loop区序列的单倍型中，富屯溪和建溪群体共享单倍型Hap 3，单倍型Hap 6为建溪和汀江所共有，省内河流可能由一个大而稳定的群体经过长期演化而产生或由多个不同系群的群体二次接触而来^[6]。南渡江和汀江群体间F_st为负值（F_st = −0.03396），且共享Hap10、Hap13、Hap14、Hap15、Hap16和Hap 22等6个单倍型，说明两群体间可能存在较频繁的基因交流，这与Cyt b基因表明的（海南）南渡江群体可能是一个独立种相矛盾（表5）。据Chen等^[17]研究发现，马口鱼种群起源可能来自珠江（9.28%）、长江（47.51%）、长江和珠江（40.56%）等3个祖先，海南马口鱼种群在更新世中期大约0.7 Ma来自珠江水系，而汀江属于广东韩江水系，2个种群间可能存在一定的交流。而鱼类区系调查为这一可能性提供了佐证^[35]，但仍待进一步采集更多样品和分子系统研究进行验证。

中性检验中Tajima’s D和Fu’s F_s是常用的推测种群是否偏离中性突变的方法^[18]。此外，若核苷酸错配分布呈泊松分布的单峰，则表明种群可能经历了种群扩张事件^[12]。本研究5个马口鱼群体中，从Tajima’s D和Fu’s F_s显著性检验发现，牡丹江、闽江富屯溪、闽江建溪和汀江群体在历史上未发生过种群扩张，且得到核苷酸错配分布图（呈多峰）的支持。但南渡江群体Tajima’s D值显著小于0，种群可能经历了规模放大和定向选择，但未得到基于D-loop区序列核苷酸错配分布图（呈多峰）的支持（图2i）。各谱系的扩张参数和分析图没有得到一致的结果，可能是因为种群的历史进程较为复杂^[18,36]，不同mtDNA片段进化速度不同造成的。