Acute toxicity and antioxidant enzyme activity effects of Cu2+ on Crassostrea hongkongensis
-
摘要:背景
香港牡蛎（Crassostrea hongkongensis）是一种肉质鲜美、营养价值丰富的经济贝类。21世纪以来，随着重金属排放日益增多，香港牡蛎的存活受到了极大的威胁。
目的探究铜离子（Cu2+）对香港牡蛎存活的影响。
方法设置5个处理组，Cu2+浓度分别为40.00、56.62、79.98、113.24和160.00 mg/L，开展96 h急性毒性试验，以及考察Cu2+胁迫对香港牡蛎不同组织（外套膜、鳃、肝胰腺、生殖腺）过氧化氢酶（CAT）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和谷胱甘肽-S转移酶（GSH-ST）活性变化的影响。
结果在Cu2+胁迫下，香港牡蛎48、72、96 h的半致死浓度（LC50）分别为116.01、84.33、65.32 mg/L，安全浓度（SC）为0.65 mg/L。在Cu2+胁迫96 h内，随着试验时间的延长，Cu2+对香港牡蛎不同组织的抗氧化酶活性均产生显著的影响（P<0.05），其中在鳃中，CAT、T-SOD酶活力呈现先上升后下降的趋势，GSH-Px酶活力呈现波浪状变化，GSH-ST酶活力呈现先下降再上升后下降的趋势；在外套膜中，CAT酶活力呈现上升的趋势，T-SOD酶活力呈现先下降后上升的趋势，GSH-Px、GSH-ST酶活力均呈现先上升后下降的趋势；在肝胰腺中，CAT酶活力呈现上升的趋势，T-SOD酶活力呈现先下降再上升后下降的趋势，GSH-Px、GSH-ST酶活力呈现先上升后下降的趋势；在生殖腺中，CAT、GSH-Px酶活力呈现先上升后下降的趋势，T-SOD酶活力呈现先下降再上升后下降的趋势，GSH-ST酶活力呈现先下降后上升的趋势。
结论香港牡蛎肝胰腺的CAT、鳃的T-SOD和GSH-ST，以及生殖腺的GSH-Px等抗氧化酶对Cu2+的敏感程度具有一定的组织特异性，该发现可作为Cu2+浓度生态监测的重要依据。本试验结果可为香港牡蛎的健康养殖提供参考。
Abstract:BackgroundCrassostrea hongkongensis is an economically valuable shellfish known for its delicious meat and rich nutritional content. Since the 21st century, with the increasing emission of heavy metals, the survival of C. hongkongensis has been greatly threatened.
ObjectiveThe aim of this study is to explore the effect of Cu2+ on the survival of C. hongkongensis.
MethodsFive treatment groups with copper concentrations of 40.00, 56.62, 79.98, 113.24 and 160.00 mg/L were set up to carry out acute toxicity tests within 96 h, and to investigate the effects of the activities of catalase, total superoxide dismutase, glutathione peroxidase and glutathione-S transferase in different tissues (mantle, gill, hepatopancreas and gonad ) of C. hongkongensis under Cu2+ stress.
ResultsUnder Cu2+ stress, the median lethal concentrations (LC50) of C. hongkongensis at 48, 72 and 96 h were 116.01, 84.33 and 65.32 mg/L, respectively, and the safe concentration (SC) was 0.65 mg/L. After 96 hours of Cu2+ stress, the antioxidant indices in different tissues of C. hongkongensis were significantly affected (P<0.05) with the extension of the experimental period. In the gill tissue, CAT and T-SOD exhibited an initial increase followed by a decrease, GSH-Px showed a fluctuating pattern, and GSH-ST demonstrated a decrease followed by an increase and then another decrease. In the mantle tissue, there was an upward trend observed for CAT, while T-SOD exhibited a decrease followed by an increase. GSH-Px and GSH-ST, on the other hand, displayed an initial increase before declining. In the hepatopancreas, CAT demonstrated an ascending trend, with T-SOD showing a complex pattern of decrease, increase, and subsequent decrease. GSH-Px and GSH-ST initially increased before trending downwards. Within the gonads, both CAT and GSH-Px followed a pattern of initial increase followed by a decrease, T-SOD showed a decrease-increase-decrease sequence, and GSH-ST decreased initially before increasing.
ConclusionCAT in the hepatopancreas, T-SOD and GSH-ST in the gill, and GSH-Px in the gonad of C. hongkongensis were sensitive to Cu2+. This finding can be used as an important basis for the ecological monitoring of the concentration of Cu2+. The results of this experiment can provide reference for the healthy breeding of C. hongkongensis.
-
Keywords:
- Crassostrea hongkongensis /
- copper ion (Cu2+) /
- acute toxicity /
- antioxidant enzyme
-
香港牡蛎（Crassostrea hongkongensis），又称香港巨牡蛎，俗称白蚝，隶属于软体动物门（Mollusca）、瓣鳃纲（Lamellibranchia）、翼形亚纲（Pterimorpjia）、珍珠贝目（Pterioida）、牡蛎科（Ostreidae）、巨蛎属（Crassostrea），主要分布于广东、广西和海南地区，少量分布于福建，通常生长在低潮线附近及入海口[1]。香港牡蛎养殖在中国已有两千多年的历史，但长期以来，其因与近江牡蛎（Crassostrea rivularis）生活环境相似、壳形差异小而难以从外观上被区分出来，二者常常被混为一谈，直到Lam等[2]通过比较线粒体 DNA 序列（16S rRNA 和 COⅠ），正式将“赤蚝”订名为近江牡蛎，“白蚝”订名为香港牡蛎。香港牡蛎具有肉质鲜美、营养价值丰富的特点，被称为“海中牛奶”，属于高蛋白、低脂肪、低胆固醇且富含锌、硒等微量元素的经济种类[3]，受到了市场的青睐以及科技工作者的关注。有研究表明，2022年香港牡蛎的年产量为1.85×106 t，占中国牡蛎年产量的31.87% ，仅次于福建牡蛎（Crassostrea angulata）[4]。
近些年来，在工业生产中，有色金属冶炼、煤炭燃烧和电子垃圾处理等产生的重金属通过地表径流等方式大量输入近海，加之养殖过程中饲料的投放、鱼药的施用等不当的养殖行为，导致近海水质受到了严重的污染[5-6]。研究表明，在食物链和食物网的流动过程中，重金属含量随着营养级的升高而逐渐下降[7]。大多数双壳贝类以滤食为主，对重金属的富集水平都相对较高，而一旦达到阈值会导致贝类的生理响应加强，造成组织损伤和血细胞活性下降，最终影响其存活。目前，近海的重金属污染以汞（Hg）、铜（Cu）为主[8]，而养殖区的重金属污染则以Cu、锌（Zn）为主[9]。因此，围绕Cu对牡蛎生长存活影响的研究也较多，如郭安琪等[10]发现，福建牡蛎对Cu的富集能力越高，其耐受能力也越强，但受到其所处生长发育阶段的影响；水环境中Cu胁迫会抑制近江牡蛎对砷（As）和铅（Pb）的积累，这与牡蛎对不同重金属积累期间发生的协同、拮抗等复杂相互作用有关[11]；铜离子（Cu2+）暴露会造成太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）鳃组织的损伤，主要表现为鳃丝肿胀、空泡增多、纤毛缺失和嗜酸性颗粒的胞质内包裹体增加等[12]。
水质理化指标是影响香港牡蛎健康生长的重要因素，如温度[13]、盐度[14]、溶解氧[15]、pH[16]等均会影响香港牡蛎的健康状况。但关于Cu2+胁迫对香港牡蛎存活影响的研究尚未见报道。因此，本研究开展Cu2+对香港牡蛎的急性毒性试验，获取48、72、96 h的半致死浓度（Half lethal concentration，LC50）和安全浓度（Safe concentration，SC），并通过测定外套膜、鳃、肝胰腺、生殖腺等组织的过氧化氢酶（Catalase，CAT）、总超氧化物歧化酶（Total superoxide dismutase，T-SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）和谷胱甘肽-S转移酶（Glutathione-S-transferase，GSH-ST）来评估Cu2+对机体的毒害程度，以期为香港牡蛎的健康养殖提供理论支撑，为水环境Cu2+污染的生态风险评价提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 材料
试验用香港牡蛎于2023年4月购自湛江沿海养殖场，随机挑选550个健康个体，壳高为（140.15±2.56）mm、壳长为（71.28±1.89）mm，将其运输回实验室，去除表面附着物，再放置于500 L塑料箱内暂养4 d。暂养期间，盐度为（18.75±0.67）、水温为（25.0±0.5）℃，每日投喂2次湛江等鞭金藻（Isochrysis zhanjiangensis），每次投喂的藻细胞密度为5×104~10×104 个/mL，每日进行1次100%换水，期间持续充气。广东海洋大学动物伦理委员会批准动物实验，批准编码为136015。
试验用水来自于广东海洋大学水产学院东海岛养殖实验基地经沉淀、砂滤处理的海水。水质分析结果显示，重金属镉（Cd）、Pb、Cu、Zn浓度分别为 0.03、0.40、0.89、7.23 μg/L，符合一类海水水质标准。试验选用分析纯的重金属污染物Cu(NO3)2·5H2O与海水制成质量浓度为30 mg/mL的母液，试验时用海水按所需浓度进行稀释，并进行现配现用。
1.2 方法
1.2.1 试验设计
1）急性毒性试验
根据预试验结果可知，当Cu2+浓度为40.00 mg/L时，香港牡蛎96 h内开始出现死亡；当Cu2+浓度为160.00 mg/L时，香港牡蛎96 h时全部死亡。因此，试验采用等对数间距法，设置5个浓度梯度分别为40.00、56.62、79.98、113.24和160.00 mg/L的处理组，以正常海水（Cu2+为0 mg/L）为对照组，每组设置3个平行。试验在55 cm×45 cm×30 cm方形塑料箱中进行，且用水量为养殖箱的1/3至1/2，每个塑料箱放入30个香港牡蛎作为1个平行。试验期间不投饵，每隔24 h更换与处理组Cu2+浓度一致的海水，其余养殖条件与暂养期一致；每3 h检查香港牡蛎的存活情况，若发现有香港牡蛎开壳，且针刺外套膜无收缩，确定为死亡，将其清除。试验持续4 d，每24 h记录1次存活情况。
2）Cu2+胁迫对抗氧化酶活性的影响
试验设置对照组和处理组，其中处理组Cu2+浓度设定为96 h LC50（65.32 mg/L），以正常海水（Cu2+浓度为0 mg/L）为对照组，每组30个香港牡蛎。试验在55 cm×45 cm×30 cm方形塑料箱中进行，分别于0、24、48、72、96 h随机从每组中取出3个香港牡蛎，用于测定其抗氧化酶（CAT、T-SOD、GSH-Px和GSH-ST）活性，每个测定设置3个重复。
1.2.2 抗氧化酶活性的测定
依次解剖出香港牡蛎的外套膜、鳃、生殖腺和肝胰腺等组织，分别取约500 mg组织与0.86%生理盐水按1∶9（W∶V）混合，匀浆机制成10％的组织匀浆，4 ℃下2 500 r/min离心10 min，取上清液，4℃保存。使用南京建成生化试剂公司生产的试剂盒测定抗氧化酶活性，所有操作均参照南京建成公司提供的试剂盒说明书进行。
1.2.3 数据分析
利用SPSS 27.0 软件中的Probit过程，构建概率单位−药物质量浓度对数直线回归方程，分别计算48、72、96 h LC50；再利用公式SC=96 h LC50/100[17]，计算SC。采用单因素方差分析（ANOVA）和Duncan法作多重比较分析。所有图表均使用Excel 2021绘制。
2. 结果与分析
2.1 Cu2+对香港牡蛎的急性毒性
如表1所示，在一定时间内，随着Cu2+胁迫浓度的增加，香港牡蛎的死亡率逐渐升高。在40.00 mg/L Cu2+胁迫72 h时，香港牡蛎开始出现死亡，平均死亡率为4.44%±2.36%；在160.00 mg/L Cu2+胁迫96 h时，香港牡蛎全部死亡。40.00 mg/L Cu2+处理组在72、96 h的死亡率与对照组存在显著差异（P<0.05）；对照组在96 h内均无死亡；不同Cu2+浓度处理组的死亡率随胁迫时间的延长，均显著增加（P<0.05）。Cu2+对香港牡蛎胁迫48、72和96 h的LC50随胁迫时间的延长，呈现逐渐降低的趋势，其中48 h最高，96 h最低，依次为116.01、84.33、65.32 mg/L；SC为0.65 mg/L。
表 1 不同浓度Cu2+对香港牡蛎的死亡率、不同胁迫时间香港牡蛎的半致死浓度和96 h安全浓度Table 1. The mortality of C. hongkongensis under different concentrations of Cu2+, the lethal concentration for 50% under different stress time and safe concentration of 96 h时间/h
Time死亡率/%
Mortality rate半致死浓度（LC50）/mg·L−1
Lethal concentration for 50%安全浓度（SC）/mg·L−1
Safe concentrationA B C D E F 24 0Ea 0Ec 8.89±4.71Dd 11.11±4.08Cd 15.56±3.85Bd 35.56±5.29Ad — 0.65 48 0Ea 0Ec 11.11±0.00Dc 28.89±2.36Cc 40.00±4.08Bc 75.56±3.27Ac 116.01 72 0Fa 4.44±2.36Eb 22.22±6.24Db 51.11±0.00Cb 62.22±6.24Bb 95.56±2.78Ab 84.33 96 0Fa 11.11±4.08Ea 33.33±2.36Da 71.11±0.00Ca 91.11±2.36Ba 100.00Aa 65.32 注：A~F为Cu2+胁迫浓度，分别为 0（对照组）、40.00、56.62、79.98、113.24、160.00 mg·L−1。同一胁迫时间不同处理组之间的差异用不同的大写字母表示差异显著（P<0.05），相同大写字母则差异不显著（P>0.05）。同一处理组不同胁迫时间之间的差异用不同的小写字母表示差异显著（P<0.05），相同小写字母则差异不显著（P>0.05），图1~图4同此。 Note: A-F are concentrations of copper, there are 0 (control group), 40.00, 56.62, 79.98, 113.24, 160.00 mg·L−1, respectively. In the same stress time, the significant differences between treatment groups are expressed by different capital letters (P<0.05), and the same letters mean no significant difference (P>0.05). In the same treatment group, the significant differences between different stress time are expressed by different lowercase letters (P<0.05), and the same letters mean no significant difference (P>0.05)，it’s the same as figure 1−figure 4. 2.2 Cu2+对香港牡蛎不同组织抗氧化酶活性的影响
2.2.1 Cu2+对香港牡蛎不同组织CAT酶活力的影响
在Cu2+胁迫96 h内，随试验时间的延长，Cu2+对香港牡蛎不同组织CAT酶活力产生显著影响（图1），敏感程度表现为肝胰腺>鳃>生殖腺>外套膜，其中外套膜（图1a）、肝胰腺（图1d）CAT酶活力基本上呈现上升的趋势，鳃（图1b）、生殖腺（图1c）CAT酶活力均呈现先上升后下降的趋势。外套膜、鳃、生殖腺、肝胰腺处理组在胁迫24、48、72、96 h时，基本上均与对照组存在显著差异（P<0.05），在96 h内CAT酶活力的最大值分别为0.545、0.557、0.636、0.615 U/mg prot。
![]()
图 1 Cu2+胁迫下香港牡蛎不同组织CAT酶活力变化Figure 1. Changes in CAT activity in different tissues of C. hongkongensis under Cu2+ stress![]()
图 2 Cu2+胁迫下香港牡蛎不同组织T-SOD酶活力变化Figure 2. Changes in T-SOD activity in different tissues of C. hongkongensis under Cu2+ stress![]()
图 3 Cu2+胁迫下香港牡蛎不同组织GSH-Px酶活力变化Figure 3. Changes in GSH-Px activity in different tissues of C. hongkongensis under Cu2+ stress![]()
图 4 Cu2+胁迫下香港牡蛎不同组织GSH-ST酶活力变化Figure 4. Changes in GSH-ST activity in different tissues of C. hongkongensis under Cu2+ stress2.2.2 Cu2+对香港牡蛎不同组织T-SOD酶活力的影响
在Cu2+胁迫96 h内，随试验时间的延长，Cu2+对香港牡蛎不同组织T-SOD酶活力产生显著影响（图2），敏感程度表现为鳃>生殖腺>肝胰腺>外套膜，其中外套膜（图2a）T-SOD酶活力呈现先下降后上升的趋势，鳃（图2b）T-SOD酶活力呈现先波动上升后下降的趋势，生殖腺（图2c）、肝胰腺（图2d）T-SOD酶活力呈现先下降再上升后下降的趋势。在Cu2+胁迫24、48、72、96 h时，外套膜、鳃、生殖腺、肝胰腺处理组基本上均与对照组存在显著差异（P<0.05），在96 h内T-SOD酶活力的最大值分别为0.740、0.806、0.770 、0.785 U/mg prot。
2.2.3 Cu2+对香港牡蛎不同组织GSH-Px酶活力的影响
在Cu2+胁迫96 h内，随试验时间的延长，Cu2+对香港牡蛎不同组织GSH-Px酶活力产生显著影响（图3），敏感程度表现为生殖腺>外套膜>鳃>肝胰腺，其中外套膜（图3a）GSH-Px酶活力呈现先下降后上升的趋势，生殖腺（图3c）、肝胰腺（图3d）GSH-Px酶活力均呈现先上升后下降的趋势，鳃（图3b）GSH-Px酶活力呈现波浪状变化。在Cu2+胁迫24、48、72、96 h时，外套膜、鳃、生殖腺、肝胰腺处理组均与对照组之间存在显著差异（P<0.05），在96 h内GSH-Px酶活力的最大值分别为0.420、0.275、0.217、0.349 U/mg prot。
2.2.4 Cu2+对香港牡蛎不同组织GSH-ST酶活力的影响
在Cu2+胁迫96 h内，随试验时间的延长，Cu2+对香港牡蛎不同组织GSH-ST酶活力产生显著影响（图4），敏感程度表现为鳃>外套膜>肝胰腺>生殖腺，其中外套膜（图4a）、肝胰腺（图4d）GSH-ST酶活力均呈现先上升后下降的趋势，鳃（图4b）GSH-ST酶活力呈现先下降再上升后下降的趋势，生殖腺（图4c）GSH-ST酶活力呈现先下降后上升的趋势。在Cu2+胁迫24、48、72、96 h时，外套膜、鳃、生殖腺、肝胰腺处理组的GSH-ST酶活力基本上均与对照组存在显著差异（P<0.05），在96 h内GSH-ST酶活力的最大值分别为0.271、0.294、0.211、0.406 U/mg prot。
3. 讨论
3.1 Cu2+对香港牡蛎的急性毒性
Cu是生物必需微量元素之一。适量的Cu2+可与蛋白质中的巯基结合，从而干扰巯基酶活性，杀灭病原体，保持水生动物体内环境的稳定[18]；而过量的Cu2+会导致水生动物的机体结构和生理功能发生异常，引起各种病变和疾病[19]，如贝类出现鳃丝肿胀、坏死，消化率下降，体质瘦弱等。因此，GB 11607—1989《渔业水质标准》规定：在养殖水体中Cu2+浓度要小于0.010 mg/L[20]，且在防治寄生虫病藻类时，建议使用铜铁合剂中的硫酸铜浓度为0.5 mg/L[21]。研究表明，文蛤（Meretrix meretrix）的急性毒性试验中Cu2+的24、48、96 h LC50和SC分别为1.66、0.46、0.12和
0.001 2 mg/L[22]；四角蛤蜊（Mactra veneriformis）的急性毒性试验中Cu2+的24、48、96 h LC50分别为13.4、7.34、4.32 mg/L，SC分别为0.13、0.07、0.04 mg/L[23]；放逸短沟蜷（Semisulcospira libertine）的急性毒性试验中Cu2+的SC为0.083 5 mg/L[24]。本试验中，香港牡蛎的SC为0.65 mg/L，与上述研究不同，一方面说明在养殖香港牡蛎的过程中，可以使用0.5 mg/L硫酸铜防治寄生虫藻病，另一方面表明香港牡蛎相较于文蛤、四角蛤蜊和放逸短沟蜷，对Cu2+具有一定的耐受性。此外，相较其他牡蛎品种而言，香港牡蛎对Cu2+的SC低于太平洋牡蛎（2.18 mg/L）[25]，高于褶牡蛎（Crassostrea plicatula，0.03 mg/L）[26]，由此可知Cu2+对不同品种牡蛎的毒性作用不同，呈现出褶牡蛎>香港牡蛎>长牡蛎的Cu2+耐受规律。因此，推测不同品种的牡蛎可作为监测Cu2+浓度的指示性生物。3.2 Cu2+对香港牡蛎不同组织抗氧化酶活性的影响
3.2.1 Cu2+对香港牡蛎不同组织CAT酶活力的影响
环境中的重金属进入无脊椎动物体内，会诱导产生大量的活性氧产物，包括过氧化氢、游离态氧等[27]。CAT可将超氧化物转化为过氧化氢（H2O2)和氧气（O2），防止过氧化物转化为羟基自由基[28]。当暴露在10 μg/L Cu2+溶液时，企鹅珍珠贝（Pteria penguin）CAT酶活力呈现上升趋势；当Cu2+浓度为20μg/L时，其CAT酶活力则呈现先上升后下降的趋势[29]。长期低剂量Cu2+毒害泥蚶（Tegillarca granosa），会阻碍泥蚶成体的性腺发育，并对其CAT酶活力产生显著的影响[30]。本研究结果表明，在65.32 mg/L Cu2+急性胁迫下，随着试验时间的延长，香港牡蛎鳃、生殖腺的CAT酶活力均呈现先上升后下降的趋势，外套膜、肝胰腺的CAT酶活力呈现上升的趋势，与上述结果不同，推测可能与试验毒物的浓度、种类和胁迫时间有关。肝胰腺是香港牡蛎主要的解毒和代谢功能器官，也是其体内主要的Cu2+富集部位[31]。本文结果中香港牡蛎CAT酶活力对Cu2+的敏感程度呈现出肝胰腺>鳃>生殖腺>外套膜的规律，也说明了这一点。Cu2+进入肝胰脏组织，催化CAT产生大量的活性氧自由基团，而CAT也一直处在较高水平而未下降，推测可能是当组织细胞受到轻度破坏时，肝胰脏因受到污染物胁迫而不断产生新的CAT，以维持氧化还原体系平衡。
3.2.2 Cu2+对香港牡蛎不同组织SOD酶活力的影响
当贝类受到污染胁迫时，能够通过呼吸爆发作用产生大量的活性氧，以帮助机体清除进入体内的病原，但过量的活性氧会导致生物体体内细胞膜的脂质化程度加快，造成损伤[32-33]。SOD广泛存在于生物细胞组织内，是一种金属酶，含Cu/Zn、锰（Mn）和铁（Fe）３种同工酶，能够催化机体内部的超氧阴离子（O2−）歧化为H2O2和O2[34]。痕量金属浓度季节性变化对地中海贻贝（Mytilus galloprovincialis）鳃中的SOD酶活力影响不大[35]。当Cu2+浓度为1.00 mg/L时，放逸短沟蜷SOD酶活力呈现先下降后上升的趋势[24]。珠母贝（Pinctada fucata）在受到亚致死浓度Cu2+和铅离子（Pb2+）胁迫24 h后，外套膜SOD酶活力会显著提高[36]。本试验结果发现，在65.32 mg/L Cu2+急性胁迫下，随着试验时间的延长，香港牡蛎外套膜的T-SOD酶活力先下降后上升，鳃的T-SOD酶活力先波动上升后下降，生殖腺、肝胰腺的T-SOD酶活力先下降再上升后下降，与上述结果不同，推测与试验毒物的浓度、组织种类有关。鳃作为双壳贝类的呼吸和滤食器官，一直与水接触，因此其也成为Cu2+残留富集的场所；若被损坏，则对摄食和呼吸作用产生重要的影响，造成体内离子失衡，最终导致贝体死亡[37]。本文结果中香港牡蛎T-SOD酶活力对Cu2+的敏感程度表现为鳃>生殖腺>肝胰腺>外套膜，推测可能是当Cu2+胁迫时，机体为了减轻鳃组织氧化损伤，不断产生SOD，同时SOD歧化反应所产生的O2也可部分补偿机体应激过程所消耗的大量O2，因此香港牡蛎鳃组织中的SOD表现出敏感的特异性[26]。
3.2.3 Cu2+对香港牡蛎不同组织GSH-Px酶活力的影响
GSH-Px可以将H2O2转化为H2O和二硫基谷胱甘肽[38]，并通过将内源性活性氧维持在相对较低水平来保护细胞免受氧自由基的损害，以减轻其应激反应产生的损害。在Cu2+急性胁迫下，太平洋牡蛎闭壳肌的GSH-Px酶活力随胁迫时间的延长，呈先上升后下降的趋势[39]。在Cu暴露下，菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum）肝胰腺和鳃的GSH-Px酶活力均随试验时间的延长，先上升后下降，且肝胰腺对重金属的富集能力大于鳃[40]。本试验结果显示，在65.32 mg/L Cu2+急性胁迫下，随着试验时间的延长，香港牡蛎外套膜GSH-Px酶活力先下降后上升，生殖腺、肝胰腺GSH-Px酶活力先上升再下降后上升，鳃GSH-Px酶活力呈现波浪状变化。由此说明在受到Cu2+胁迫时，香港牡蛎的GSH-Px酶被激活，以应对氧化损伤，但随着胁迫时间的延长，可能会超过机体的耐受限度，因此GSH-Px酶受到抑制。出现与上述研究不同的原因推测是香港牡蛎在一定胁迫时间后会适应Cu2+浓度，从而激发机体的修复与二次防御。而生殖腺GSH-Px酶活力对Cu2+最为敏感，这是因为GSH-Px具有保护生殖腺细胞膜中的多不饱和脂肪酸免受氧化损伤的作用，Cu2+通过香港牡蛎的滤食作用进入体内，而对于处在生殖期的香港牡蛎，Cu2+会在其生殖腺中富集，从而引起GSH-Px含量的增多。
3.2.4 Cu2+对香港牡蛎不同组织GSH-ST酶活力的影响
GSH-ST广泛分布于植物、动物、酵母和细菌等生物体中，作为多功能蛋白质，在外源性化合物的药物代谢、生物转化和保护机体免受氧化损伤等方面发挥着重要作用[41]。在Cu2+胁迫下，皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai）幼鲍肝胰脏GSH-ST酶活力随着时间的延长而呈下降的趋势[42]。在20 μg/L Cu2+胁迫下，GSH-ST基因在第10天达到最高表达量，约为对照组（Cu2+浓度为0 μg/L）的6.95倍；背角无齿蚌（Anodonta woodiana）鳃的 GSH-ST酶活力在0.168、0.675 mg/L Cd暴露期间均显著高于对照组（0 mg/L Cd）[43]。本试验结果表明，在65.32 mg/L Cu2+急性胁迫下，随着试验时间的延长，香港牡蛎外套膜、肝胰腺GSH-ST酶活力均先上升后下降，鳃GSH-ST酶活力先下降再上升后下降。出现与上述结果不同的原因推测可能是由胁迫时间设置等实验条件设计不同造成的。贝类外套膜组织的主要作用是保护内脏团和贝壳的形成与修复[44]，如当受到外界Cu胁迫96 h时，魁蚶（Scapharca broughtonii）外套膜黏膜大面积充血，边缘充血并向内翻卷[45]。本研究结果中香港牡蛎外套膜GSH-ST酶活力对Cu2+较为敏感，推测少量Cu2+进入香港牡蛎外套膜后与GSH-ST上的活性中心结合，激活了GSH-ST，以应对氧化损伤，但随着胁迫时间的延长，活性氧大量产生，造成机体组织损伤，从而抑制GSH-ST的活性。
4. 结论
通过Cu2+急性毒性试验，获得香港牡蛎48、72、96 h的LC50分别为116.01、84.33、65.32 mg/L，以及SC为0.65 mg/L，同时以96 h LC50（Cu2+浓度为65.32 mg/L）作为胁迫浓度，深入探究香港牡蛎不同组织抗氧化酶活性在96 h内的变化趋势，揭示了不同组织Cu2+胁迫下免疫指标的应激过程。试验结果表明，香港牡蛎肝胰腺的CAT、鳃的T-SOD和GSH-ST、生殖腺的GSH-Px对Cu2+的敏感程度具有组织特异性。本试验结果可为香港牡蛎的健康养殖提供参考。
-
![]()
图 1 Cu2+胁迫下香港牡蛎不同组织CAT酶活力变化
注：与对照组相比，处理组具有显著差异用不同大写字母标出。图1~图4同此。
Figure 1. Changes in CAT activity in different tissues of C. hongkongensis under Cu2+ stress
Note: Compared with the control group, the treatment group shows significant differences marked with different capital letters. It’s the same as figure 1-figure 4.
![]()
图 2 Cu2+胁迫下香港牡蛎不同组织T-SOD酶活力变化
Figure 2. Changes in T-SOD activity in different tissues of C. hongkongensis under Cu2+ stress
![]()
图 3 Cu2+胁迫下香港牡蛎不同组织GSH-Px酶活力变化
Figure 3. Changes in GSH-Px activity in different tissues of C. hongkongensis under Cu2+ stress
![]()
图 4 Cu2+胁迫下香港牡蛎不同组织GSH-ST酶活力变化
Figure 4. Changes in GSH-ST activity in different tissues of C. hongkongensis under Cu2+ stress
表 1 不同浓度Cu2+对香港牡蛎的死亡率、不同胁迫时间香港牡蛎的半致死浓度和96 h安全浓度
Table 1 The mortality of C. hongkongensis under different concentrations of Cu2+, the lethal concentration for 50% under different stress time and safe concentration of 96 h
时间/h
Time死亡率/%
Mortality rate半致死浓度（LC50）/mg·L−1
Lethal concentration for 50%安全浓度（SC）/mg·L−1
Safe concentrationA B C D E F 24 0Ea 0Ec 8.89±4.71Dd 11.11±4.08Cd 15.56±3.85Bd 35.56±5.29Ad — 0.65 48 0Ea 0Ec 11.11±0.00Dc 28.89±2.36Cc 40.00±4.08Bc 75.56±3.27Ac 116.01 72 0Fa 4.44±2.36Eb 22.22±6.24Db 51.11±0.00Cb 62.22±6.24Bb 95.56±2.78Ab 84.33 96 0Fa 11.11±4.08Ea 33.33±2.36Da 71.11±0.00Ca 91.11±2.36Ba 100.00Aa 65.32 注：A~F为Cu2+胁迫浓度，分别为 0（对照组）、40.00、56.62、79.98、113.24、160.00 mg·L−1。同一胁迫时间不同处理组之间的差异用不同的大写字母表示差异显著（P<0.05），相同大写字母则差异不显著（P>0.05）。同一处理组不同胁迫时间之间的差异用不同的小写字母表示差异显著（P<0.05），相同小写字母则差异不显著（P>0.05），图1~图4同此。 Note: A-F are concentrations of copper, there are 0 (control group), 40.00, 56.62, 79.98, 113.24, 160.00 mg·L−1, respectively. In the same stress time, the significant differences between treatment groups are expressed by different capital letters (P<0.05), and the same letters mean no significant difference (P>0.05). In the same treatment group, the significant differences between different stress time are expressed by different lowercase letters (P<0.05), and the same letters mean no significant difference (P>0.05)，it’s the same as figure 1−figure 4. 
下载: 导出CSV
-
[1] 赵乃乾. 盐度对牡蛎“华南1号”新品种胚胎发育的影响及早期生长的比较研究[D]. 南宁:广西大学,2019. Zhao N Q. Effect of salinity on embryo development and comparative study of oyster “South China No. 1” in early growth[D]. Nanning: Guangxi University, 2019.
[2] Lam K, Morton B. Mitochondrial DNA and morphological identification of a new species of Crassostrea (Bivalvia: Ostreidae) cultured for centuries in the Pearl River Delta, Hong Kong, China[J]. Aquaculture, 2003, 228(1−4): 1 − 13. DOI: 10.1016/S0044-8486(03)00215-1
[3] 陈明波. 香港牡蛎绿色健康育肥技术[J]. 科学养鱼,2024(5):66 − 67. DOI: 10.3969/j.issn.1004-843X.2024.05.035 Chen M B. Green and healthy fattening technology of Crassostrea hongkongensis[J]. Scientific Fish Farming, 2024(5): 66 − 67. DOI: 10.3969/j.issn.1004-843X.2024.05.035
[4] 农业农村部渔业渔政管理局,全国水产技术推广总站,中国水产学会编. 2023中国渔业统计年鉴[M]. 北京:中国农业出版社,2023. Bureau of Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs of the People’s Republic of China, National Fisheries Technology Extension Center, China Society of Fisheries. 2023 China fishery statistical yearbook[M]. Beijing: China Agriculture Press, 2023.
[5] 刘欢. 我国水产养殖业生态化研究[D]. 南京:南京林业大学,2014. Liu H. Study on the ecological development of Chinese aquaculture industry[D]. Nanjing: Nanjing Forestry University, 2014.
[6] Zarykhta V V, Zhang Z H, Kholodkevich S V, et al. Comprehensive assessments of ecological states of Songhua River using chemical analysis and bivalves as bioindicators[J]. Environmental Science and Pollution Research, 2019, 26(32): 33341 − 33350. DOI: 10.1007/s11356-019-06349-7
[7] Feng J X, Gao Q F, Dong S L. Transference of heavy metals (Hg, Cu, Pb and Zn) with the trophic structure in a polyculture pond: evidence from nitrogen stable isotope[J]. Aquaculture Research, 2016, 47(6): 1996 − 2003. DOI: 10.1111/are.12655
[8] 谷阳光. 广东沿海沉积物中生源要素、重金属分布及其潜在生态危害评价[D]. 广州:暨南大学,2009. Gu Y G. Distributions of biogenic elements, heavy metals and potential ecological risk assessment of heavy metal in surface sediments from coastal sea of Guandong Province[D]. Guangzhou: Jinan University, 2009.
[9] 于建霖,康会会,孔庆霞. 水产养殖尾水处理技术研究进展[J]. 天津农业科学,2023,29(S1):83 − 91. Yu J L, Kang H H, Kong Q X. Research progress of aquaculture tailwater treatment technology[J]. Tianjin Agricultural Sciences, 2023, 29(S1): 83 − 91.
[10] 郭安琪,柯才焕,王恬,等. 不同金属富集能力品系福建牡蛎铜、锌耐受性分析[J]. 渔业研究,2024,46(4):338 − 346. Guo A Q, Ke C H, Wang T, et al. Analysis of copper and zinc tolerance in the different metal accumulation ability strains of Crassostrea angulata[J]. Journal of Fisheries Research, 2024, 46(4): 338 − 346.
[11] 卓文,陈新,刘秋妤,等. 铜离子胁迫对近江牡蛎软体组织及贝壳重金属含量的影响[J]. 热带生物学报,2019,10(1):1 − 5. Zhuo W, Chen X, Liu Q Y, et al. Changes of heavy metals in the soft tissue and shell of Crassostrea rivularis under the stress of Cu2+[J]. Journal of Tropical Biology, 2019, 10(1): 1 − 5.
[12] 曹瑞文. 海水酸化和痕量金属(Cd2+和Cu2+)对经济贝类的复合毒性效应研究[D]. 烟台:中国科学院大学(中国科学院烟台海岸带研究所),2019. Cao R W. Combined oxic effects of seawater acidification and trace metals (Cd2+, Cu2+) on economic shellfish[D]. Yantai: University of Chinese Academy of Sciences (Yantai Institute of Coastal Zone Research, Chinese Academy of Sciences ), 2019.
[13] 官俊良,何庆松,张兴志,等. 温度和盐度对香港牡蛎碳收支的影响[J]. 南方农业学报,2024,55(8):2504 − 2513. DOI: 10.3969/j.issn.2095-1191.2024.08.028 Guan J L, He Q S, Zhang X Z, et al. Effects of temperature and salinity on carbon budget of Crassostrea hongkongensis[J]. Journal of Southern Agriculture, 2024, 55(8): 2504 − 2513. DOI: 10.3969/j.issn.2095-1191.2024.08.028
[14] 彭业韶. 香港牡蛎盐度胁迫转录组响应及相关基因功能研究[D]. 钦州:北部湾大学,2022. Peng Y S. Transcriptome response and related gene function of Crassostrea hongkongensis under salinity stress[D]. Qinzhou: Beibu Gulf University, 2022.
[15] 马元. 香港牡蛎对低氧胁迫的生理响应及转录组分析[D]. 钦州:北部湾大学,2022. Ma Y. Physiological response and transcriptome analysis to hypoxia stress in Crassostrea hongkongensis[D]. Qinzhou: Beibu Gulf University, 2022.
[16] 陈梓傲. 酸化对香港牡蛎的生长影响及矿化关键基因介导的分子机制[D]. 钦州:北部湾大学,2023. Chen Z A. Effect of acidification on growth and molecular mechanisms mediated by key genes of mineralization in the Crassostrea hongkongensis[D]. Qinzhou: Beibu Gulf University, 2023.
[17] Mariño-Balsa J C, Poza E, Vázquez E, et al. Comparative toxicity of dissolved metals to early larval stages of Palaemon serratus, Maja squinado, and Homarus gammarus (Crustacea: Decapoda)[J]. Archives of Environmental Contamination and Toxicology, 2000, 39(3): 345 − 351. DOI: 10.1007/s002440010114
[18] 林国清. 4种重金属盐对泥东风螺幼螺的急性毒性试验[J]. 福建农业学报,2012,27(3):232 − 236. DOI: 10.3969/j.issn.1008-0384.2012.03.004 Lin G Q. Acute toxicity tests of four heavy metal salts to juvenile snail of Babylonia lutosa[J]. Fujian Journal of Agricultural Sciences, 2012, 27(3): 232 − 236. DOI: 10.3969/j.issn.1008-0384.2012.03.004
[19] 赵云龙,李琳琪,乔淑芬,等. 铜离子对花鳅急性毒性研究[J]. 水产学杂志,2020,33(5):65 − 69. DOI: 10.3969/j.issn.1005-3832.2020.05.011 Zhao Y L, Li L Q, Qiao S F, et al. Acute toxicity of copper ion to spined loach Cobitis taenia[J]. Chinese Journal of Fisheries, 2020, 33(5): 65 − 69. DOI: 10.3969/j.issn.1005-3832.2020.05.011
[20] 国家环境保护局. 渔业水质标准:GB 11607—1989[S]. 北京:中国标准出版社,1990. State Bureau of Environment Protection. Water quality standard for fisheries: GB 11607—1989[S]. Beijing: Standards Press of China, 1990.
[21] 周晓英,朱惠辉. 硫酸铜在水产养殖中的应用[J]. 江西农业科技,2003(11):31 − 33. Zhou X Y, Zhu H H. Application of copper sulfate in aquaculture[J]. Jiangxi Agricultural Science & Technology, 2003(11): 31 − 33.
[22] 张宜奎,宋秀凯,刘爱英,等. 重金属Cd2+、Cu2+对文蛤的急性毒性[J]. 海洋湖沼通报,2011(3):51 − 56. DOI: 10.3969/j.issn.1003-6482.2011.03.008 Zhang Y K, Song X K, Liu A Y, et al. Acute toxicity effects of Cd2+ and Cu2+ on Meretrix meretrix Linnaeus[J]. Transactions of Oceanology and Limnology, 2011(3): 51 − 56. DOI: 10.3969/j.issn.1003-6482.2011.03.008
[23] 宫春光,殷蕊,孙桂清,等. 重金属Cu2+对四角蛤蜊的急性毒性及肝脏组织结构的影响[J]. 河北渔业,2016 (7):1−4,74. Gong C G, Yin R, Sun G Q, et al. Effects of heavy metal Cu2+ on acute toxicity and liver tissue structure of Mactra veneriformis[J]. Hebei Fisheries, 2016(7): 1−4, 74.
[24] 秦媛,林业宏,侯颖怡,等. 氨氮和重金属Cu2+对放逸短沟蜷的急性毒性及氧化胁迫效应[J]. 水产养殖,2024,45(1):15 − 21. DOI: 10.3969/j.issn.1004-2091.2024.01.003 Qin Y, Lin Y H, Hou Y Y, et al. Acute toxicity and oxidative stress effects of ammonia nitrogen and heavy metal Cu2+ on Semisulcospira libertine[J]. Journal of Aquaculture, 2024, 45(1): 15 − 21. DOI: 10.3969/j.issn.1004-2091.2024.01.003
[25] 刘伟,鞠青,刘星辰. 重金属Cu2+、Pb2+、Cd2+对太平洋牡蛎的急性毒性效应[J]. 河北渔业,2021(10):1 − 4. DOI: 10.3969/j.issn.1004-6755.2021.10.001 Liu W, Ju Q, Liu X C. Acute toxic effects of copper, lead and cadmium on Crassostrea gigas[J]. Hebei Fisheries, 2021(10): 1 − 4. DOI: 10.3969/j.issn.1004-6755.2021.10.001
[26] 李诗逸,孙继鹏,洪专,等. Zn2+、Cd2+、Cu2+、Cr6+和Se4+对褶牡蛎急性毒性效应研究[J]. 海洋环境科学,2015,34(6):813 − 818. Li S Y, Sun J P, Hong Z, et al. Acute toxic effects of zinc, cadmium, copper, chromium, selenium on Crassostrea plicatula[J]. Marine Environmental Science, 2015, 34(6): 813 − 818.
[27] 徐彦. 菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)对重金属离子Cd2+、Pb2+免疫应激响应的研究[D]. 青岛:中国海洋大学,2012. Xu Y. Studies on immune responses to heavy metal ions—Cd2+, Pb2+ in Ruditapes philippinarum[D]. Qingdao: Ocean University of China, 2012.
[28] 刘辰凤. 长牡蛎健康状态评估与指标筛选[D]. 大连:大连海洋大学,2024. Liu C F. Pacific oyster (Crassostrea gigas) health status assessment and indicator screening[D]. Dalian: Dalian Ocean University, 2024.
[29] 严俊贤,李有宁,于刚,等. 企鹅珍珠贝抗氧化系统对铜暴露的响应[J]. 水产科学,2018,37(4):494 − 498. Yang J X, Li Y N, Yu G, et al. Responses of antioxidant system in pearl oyster Pteria pengiunto copper exposure[J]. Fisheries Science, 2018, 37(4): 494 − 498.
[30] 刘广绪,邵艳卿,柴雪良,等. 长期低剂量重金属Cu2+、Zn2+、Pb2+、Cd2+对滩涂贝类泥蚶成体滤食率、性腺发育、抗氧化酶系统以及MT基因表达的毒性作用[C]//中国动物学会贝类分会,中国海洋湖沼学会贝类分会. 中国动物学会·中国海洋湖沼学会贝类分会第九次会员代表大会暨第十五次学术讨论会会议摘要集. 广州:中国动物学会贝类分会,中国海洋湖沼学会贝类分会,2011:2. Liu G X, Shao Y Q, Chai X L, et al. The toxic effects of long-term low-dose heavy metals Cu2+, Zn2+, Pb2+ and Cd2+ on the filter feeding rate, gonadal development, antioxidant enzyme system and MT gene expression of adult Tegillarca granosa in tidal flats[C]//Chinese Zoological Society Shellfish Branch, Chinese Society of Oceanography and Limnology Shellfish Branch. Abstracts of the Ninth Members, Congress and the Fifteenth Symposium of Chinese Society of Zoology and Chinese Society of Marine Lakes and Marsh Shellfish. Guangzhou: Chinese Zoological Society Shellfish Branch, Chinese Society of Oceanography and Limnology Shellfish Branch, 2011: 2.
[31] 张晓宇,李斐,吉成龙,等. 海洋双壳类中镉与必需元素的相互作用[J]. 生态毒理学报,2024,19(4):206 − 216. DOI: 10.7524/AJE.1673-5897.20240129001 Zhang X Y, Li F, Ji C L, et al. Interactions between cadmium and essential elements in marine bivalves[J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2024, 19(4): 206 − 216. DOI: 10.7524/AJE.1673-5897.20240129001
[32] Canesi L, Viarengo A, Leonzio C, et al. Heavy metals and glutathione metabolism in mussel tissues[J]. Aquatic Toxicology, 1999, 46(1): 67 − 76. DOI: 10.1016/S0166-445X(98)00116-7
[33] Luna-Acosta A, Kanan R, Le Floch S, et al. Enhanced immunological and detoxification responses in Pacific oysters, Crassostrea gigas, exposed to chemically dispersed oil[J]. Water Research, 2011, 45(14): 4103 − 4118. DOI: 10.1016/j.watres.2011.05.011
[34] 王颖. 红树蚬Cu/ZnSOD、MnSOD的基因差异及对Cu2+和Cr6+的胁迫响应[D]. 海口:海南大学,2021. Wang Y. Differences of Cu/ZnSOD and MnSOD genes in Geloina erosa and their responses to Cu2+ and Cr6+ stress [D]. Haikou: Hainan University, 2021.
[35] Vlahogianni T H, Valavanidis A. Heavy-metal effects on lipid peroxidation and antioxidant defence enzymes in mussels Mytilus galloprovincialis[J]. Chemistry and Ecology, 2007, 23(5): 361 − 371. DOI: 10.1080/02757540701653285
[36] Jing G, Li Y, Xie L P, et al. Metal accumulation and enzyme activities in gills and digestive gland of pearl oyster (Pinctada fucata) exposed to copper[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology, 2006, 144(2): 184 − 190.
[37] 李腾,卢怡凝,冼健安,等. 水环境中微塑料的分布及其对水产动物的影响研究进展[J]. 安徽农业科学,2024,52(11):5 − 10. DOI: 10.3969/j.issn.0517-6611.2024.11.002 Li T, Lu Y N, Xian J A, et al. Research progress on the distribution of microplastics in the aquatic environment and their effects on aquatic animals[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2024, 52(11): 5 − 10. DOI: 10.3969/j.issn.0517-6611.2024.11.002
[38] Falfushinska H I, Romanchuk L D, Stolyar O B. Different responses of biochemical markers in frogs (Rana ridibunda) from urban and rural wetlands to the effect of carbamate fungicide[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology, 2008, 148(3): 223 − 229.
[39] 高层. 重金属Pb2+和Cu2+对太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)毒性效应的比较研究[D]. 青岛:中国海洋大学,2012 Gao C. Toxic effects of heavy mental Pb2+ and Cu2+ to the Crassostrea gigas[D]. Qingdao: Ocean University of China, 2012.
[40] 张林宝,吴惠丰,孙伟,等. 菲律宾蛤仔对镉、铜暴露的蓄积作用及其抗氧化酶系统的响应研究[J]. 南方水产科 学,2013,9(5):64 − 70. Zhang L B, Wu H F, Sun W, et al. Bioaccumulation and antioxidant responses in Manila clam (Ruditapes philippinarum) under cadmium and copper exposure[J]. South China Fisheries Science, 2013, 9(5): 64 − 70.
[41] 陈丽竹. 菲律宾蛤仔无机砷甲基转化及其分子机制的研究[D]. 烟台:中国科学院大学(中国科学院烟台海岸带研究所),2016. Chen L Z. Studies on the methylation of inorganic arsenic and its molecular mechanism in the clam Ruditapes philippinarum[D]. Yantai: University of Chinese Academy of Sciences (Yantai Institute of Coastal Zone Research, Chinese Academy of Sciences ), 2016.
[42] 类延菊. Cu和Cd对皱纹盘鲍幼鲍的毒性及饲料硒和硫辛酸对其解毒作用的研究[D]. 青岛:中国海洋大学,2014 Lei Y J. The toxicity effects of copper and cadmium and the possible protective effects of selenium and α-lipoic acid on juvenile abalone Haliotis discus hannai Ino[D]. Qingdao: Ocean University of China, 2014.
[43] 井维鑫,刘娜,王兰. 镉对背角无齿蚌鳃组织抗氧化酶活性的影响[J]. 山西农业科学,2018,46(5):752 − 755. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2481.2018.05.19 Jing W X, Liu N, Wang L. Effects of cadmium on the activities of antioxidant enzymes in the gill of Anodonta woodiana[J]. Journal of Shanxi Agricultural Sciences, 2018, 46(5): 752 − 755. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2481.2018.05.19
[44] 何志巧,范孝俊,刘菲,等. 尿素对厚壳贻贝外套膜在酸化条件下贝壳损伤-修复过程的影响[J]. 水生生物学报,2024,48(7):1170 − 1182. He Z Q, Fan X J, Liu F, et al. Urea on shell damage-repair process of mantle under ocean acidification[J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2024, 48(7): 1170 − 1182.
[45] 丁丹勇. 生态因子对香港牡蛎重金属排出及其营养成分的影响[D]. 湛江:广东海洋大学,2018. Ding D Y. Effect of ecological factors on heavy metal emissions and nutritional components of Crassostrea hongkongesis[D]. Zhanjiang: Guangdong Ocean University, 2018.
计量
- 文章访问数: 14
- HTML全文浏览量: 3
- PDF下载量: 0
