Mitochondrial genome characteristics and phylogenetic analysis in Portunidae
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摘要:目的
线粒体基因在物种鉴定、起源和进化研究中展现出较高的效率和准确性，目前已有23种梭子蟹完成了线粒体全基因组测序，但基于比较基因组学方法对梭子蟹科线粒体进行基因组特征及系统进化关系的研究仍较少。本研究旨在探究梭子蟹科（Portunidae）蟹类的线粒体基因组特征，筛选适用于梭子蟹科物种快速鉴定的分子标记，并阐明梭子蟹科的系统发育关系。
方法采用比较基因组学方法，对23种梭子蟹的线粒体全基因组序列进行分析。通过差异位点分析筛选物种快速鉴定的分子标记，并基于13个蛋白质编码基因（PCGs）的核苷酸序列，运用最大似然法（ML）和贝叶斯推断法（BI）构建系统发育树，同时进行分歧时间估算。
结果梭子蟹科线粒体基因组具有高度保守性，未发现基因重排现象，且表现出显著的AT偏好性。选择压力分析显示，13个PCGs的Ka/Ks值均在0到1之间，表明这些基因均受到纯化选择作用。差异位点分析显示，nad5、nad4和rrnL基因因较长的序列长度和较高的变异位点比例，可作为梭子蟹科物种快速鉴定的理想分子标记。系统发育分析表明，光背蟹属（Lissocarcinus）、狼牙蟹属（Lupocycloporus）、单梭蟹属（Monomia）、梭子蟹属（Portunus）、青蟹属（Scylla）、蟳属（Charybdis）及美青蟹属（Callinectes）7个属均为单系群，双额短桨蟹（Thalamita sima）未与短浆蟹属（Thalamita）聚为一支，而是与蟳属（Charybdis）关系更密切，这一结果得到遗传距离分析的支持。分歧时间估算结果显示，梭子蟹科的起源至少可追溯至三叠纪，其中光背蟹属是较为古老的一支，现存梭子蟹大多分化自古近纪。
结论23种梭子蟹线粒体基因组较保守，其中nad5、nad4以及rrnL基因是梭子蟹科物种快速鉴定的理想分子标记。在系统发育树中，短浆蟹属呈现出非单系群的分布特征。本研究结果为梭子蟹科物种的快速鉴定、遗传进化研究及分歧时间推断提供了重要的理论依据和数据支持。
Abstract:ObjectiveMitochondrial genes have proven to be highly effective and precise tools for species identification, origin tracing, and evolutionary research. Although complete mitochondrial genomes of 23 species in Portunidae have been sequenced, comparative genomic analyses of mitochondrial genome characteristics and phylogenetic relationships within this family remain limited. This study aims to investigate the mitochondrial genome features of species in Portunidae, identify molecular markers suitable for rapid species identification, and elucidate the phylogenetic relationships within the family.
MethodsComparative genomics approaches were applied to analyze the complete mitochondrial genomes of 23 species in Portunidae. Polymorphic site analysis was conducted to screen molecular markers for rapid species identification. Phylogenetic trees were reconstructed using maximum likelihood (ML) and Bayesian inference (BI) based on nucleotide sequences of 13 protein-coding genes (PCGs), alongside divergence time estimation.
ResultsThe mitochondrial genomes of species in Portunidae exhibited high structural conservation with no gene rearrangements and significant AT bias. Selection pressure analysis revealed that all 13 PCGs underwent purifying selection. Polymorphic site analysis identified nad5, nad4, and rrnL as ideal molecular markers for rapid species identification due to their longer sequence lengths and higher proportions of variable sites. Phylogenetic analysis demonstrated monophyly in seven genera, including Lissocarcinus and Lupocycloporus. Notably, Thalamita sima clustered more closely with Charybdis than with its nominal genus Thalamita, a result supported by genetic distance analysis. Divergence time estimation suggested that species in Portunidae originated no later than the Triassic period, with Lissocarcinus representing an ancient lineage, while most extant species diverged during the Paleogene.
ConclusionsThe mitochondrial genomes of 23 species in Portunidae species are evolutionarily conserved. The nad5, nad4, and rrnL genes serve as effective molecular markers for rapid species identification, and the genus Thalamita exhibits non-monophyletic clustering in the phylogenetic tree. This study provides crucial theoretical foundations and datasets for rapid species identification, evolutionary studies, and divergence time estimation in Portunidae, advancing the understanding of their phylogenetic framework and evolutionary history.
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Keywords:
- Portunidae /
- mitochondrial gene /
- phylogeny /
- divergence time
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梭子蟹科（Portunidae）隶属于节肢动物门（Arthropoda）、甲壳纲（Crustacea）、十足目（Decapoda），是一类具有重要经济和生态价值的海洋生物[1]，广泛分布于全球温带至热带海域的潮间带至深海区域[2]，该科包含35属、300余种，其中中国海域记录的种类超过60种[3]。作为海洋生态系统的重要组分，梭子蟹不仅是渔业资源的重要物种，其营养与药用价值亦备受关注[2]。研究表明，梭子蟹肌肉组织富含钙、铁等矿物质及抗氧化活性肽，具有显著的营养保健价值[4]。例如三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）的卵油具有预防肥胖和改善肠道健康的潜力[5]；锯缘青蟹（Scylla serrata）的壳聚糖可以通过减轻炎症反应有效地改善肾脏和肝脏功能[6]。在生态领域，梭子蟹对维持海洋生态系统平衡发挥重要作用[7]，同时部分种类如蓝蟹（Callinectes sapidus）作为入侵物种影响入侵地区生物群落结构[8]。此外，蓝蟹因对环境污染物的敏感性，在生态毒理学研究中被广泛用作为模式生物[9]。
在分类研究方面，尽管过去二十年间梭子蟹科的新物种不断被发现[7]，但由于梭子蟹的形态特征较为相似，仅凭形态特征进行鉴定的准确性较低[10-11]。例如Xiphonectes unidens与Xiphonectes hastatoides在形态上极为相似，极易造成鉴定错误[12]。相比之下，线粒体基因在物种鉴定、起源和进化研究中展现出更高的效率和准确性[13-14]。目前，梭子蟹的分子鉴定主要采用cox1或16S rRNA基因作为分子标记[15]，例如通过cox1基因分析，从40尾梭子蟹中成功鉴定出39个Portunus segnis[16]。利用cox1和16S rRNA基因从15种短尾蟹幼体中准确鉴定出9种梭子蟹[15]。然而，学术界尚未就梭子蟹科物种快速鉴定的分子标记基因达成共识，且梭子蟹科的系统发育关系仍需进一步明确[17-18]。当前的研究大多依赖单基因片段构建系统发育树，但以不同单基因片段构建的系统发育树在拓扑结构上存在显著差异，影响了各物种间分类地位的界定[2]。例如基于16S rRNA和cox1基因分别构建的梭子蟹科系统发育树显示，两者之间存在显著的拓扑结构差异[19]。因此，梭子蟹科内部的系统发育关系仍需进一步探索和完善。
目前已有23种梭子蟹完成了线粒体全基因组测序[如远海梭子蟹（Portunus pelagicus）[20]、双额短桨蟹（Thalamita sima）[21]等]，初步揭示了其基因组成、碱基偏好及密码子使用模式等特征。然而，现有研究多集中于单一物种或少数近缘种的基因组描述，缺乏对梭子蟹科物种间线粒体基因组特征的系统性比较。此外，尽管梭子蟹线粒体基因排列模式与短尾次目祖先物种高度相似，但针对梭子蟹科内部基因重排事件的探究仍较为匮乏，难以全面评估其基因组重排的进化规律。例如拟曼赛因青蟹（Scylla paramamosain）的线粒体基因排列与大多数节肢动物一致，但其与梭子蟹科其他物种间的基因顺序差异尚未得到充分解析[22]。在系统发育研究领域，现有文献多聚焦于单一物种线粒体基因组特征的描述性报道，并以此为基础进行辅助性系统发育树构建，但普遍存在分类单元覆盖度不足与拓扑结构可靠性较低的问题。例如针对钝齿蟳（Charybdis hellerii）的线粒体基因组研究所构建的梭子蟹科系统发育树仅纳入17个物种，受限于样本量不足，其部分节点支持率较低，难以全面反映梭子蟹科的多样性[23]。尽管比较基因组学方法在解析基因组特征与系统进化关系方面具有显著优势[24-25]，但其在梭子蟹科中的应用仍较为稀缺。因此，本研究通过对23种梭子蟹线粒体基因组的结构特征进行分析，筛选适用于物种快速鉴定的分子标记，并基于多基因联合数据集探讨梭子蟹科内部的系统发育关系及分化时间，旨在为梭子蟹的快速鉴定提供可靠的遗传标记，也为厘清梭子蟹科内各物种间的进化关系及演化历史奠定分子基础。
1. 材料与方法
1.1 数据获取
从GenBank公共数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/）检索并获取了梭子蟹科8属23种梭子蟹线粒体基因组全序列，其物种名称及GenBank登录号等详见表1。
表 1 梭子蟹科物种线粒体基因组的基本特征Table 1. Basic characteristics of mitogenome of Portunidae属
Genera种名
SpeciesGenBank接收号
GenBank accession number长度/bp
LengthAT含量/%
AT contentAT偏倚
AT-skewGC偏倚
GC-skew短浆蟹属
Thalamita刺腕短桨蟹
Thalamita spinicarpaNC_069015.1 15 783 69.2 −0.018 −0.227 底栖短桨蟹
Thalamita prymnaNC_069014.1 15 807 68.7 0.011 −0.269 整洁短桨蟹
Thalamita integraNC_069013.1 15 773 66.7 −0.039 −0.188 少刺短桨蟹
Thalamita danaeNC_069012.1 15 809 69.9 0.004 0.272 双额短桨蟹
Thalamita simaNC_039640.1 15 831 71.7 −0.016 −0.242 钝齿短桨蟹
Thalamita crenataNC_024438.1 15 787 69.7 −0.013 −0.240 蟳属
Charybdis环纹蟳
Charybdis annulataNC_069011.1 15 747 67.8 −0.014 −0.269 钝齿蟳
Charybdis helleriiNC_060621.1 15 913 70.2 −0.038 −0.252 双斑蟳
Charybdis bimaculataNC_037695.1 15 714 71.6 −0.051 −0.194 善泳蟳
Charybdis natatorNC_036132.1 15 664 70.4 −0.034 −0.253 锈斑蟳
Charybdis feriataNC_024632.1 15 660 70.2 −0.028 −0.246 日本蟳
Charybdis japonicaNC_013246.1 15 738 69.2 −0.024 −0.228 光背蟹属
Lissocarcinus阿嘎光背蟹
Lissocarcinus arkatiNC_057302.1 15 510 67.2 −0.012 −0.311 狼牙蟹属
Lupocycloporus纤手梭子蟹
Lupocycloporus gracilimanusNC_040124.1 15 990 69.7 −0.024 −0.258 单梭蟹属
Monomia拥剑梭子蟹
Monomia gladiatorNC_037173.1 15 878 69.0 −0.034 −0.242 梭子蟹属
Portunus红星梭子蟹
Portunus sanguinolentusNC_028225.1 16 024 65.6 −0.037 −0.250 远海梭子蟹
Portunus pelagicusNC_026209.1 16 157 68.7 −0.019 −0.219 三疣梭子蟹
Portunus trituberculatusNC_005037.1 16 026 70.2 −0.051 −0.241 青蟹属
Scylla拟曼赛因青蟹
Scylla paramamosainNC_012572.1 15 825 73.0 −0.047 −0.247 橄榄青蟹
Scylla olivaceaNC_012569.1 15 723 69.4 −0.035 −0.267 特兰克巴尔青蟹
Scylla tranquebaricaNC_012567.1 15 833 73.7 −0.047 −0.247 锯缘青蟹
Scylla serrataNC_012565.1 15 775 72.6 −0.047 −0.242 美青蟹属
Callinectes蓝蟹
Callinectes sapidusNC_006281.1 16 263 69.1 −0.011 −0.279 1.2 线粒体基因组序列分析
使用MAFFT 7.505[26]对23种梭子蟹13个蛋白质编码基因（Protein-coding genes，PCGs）进行单基因比对。通过PhyloSuite 1.2.3[27]分析各氨基酸同义密码子相对使用度（Relative synonymous codon usage，RSCU）。利用KaKs_calculator 2.0[28]计算同义替换率（Ks）和非同义替换率（Ka），遗传密码子选择无脊椎动物线粒体密码子，计算方法选择近似法中的Yang-Nielsen法（YN）。此外，使用DnaSP 6[29]对比对后的13个PCGs和2个rRNA基因进行差异分析，分别统计总位点数、保守位点数、变异位点数、单现突变数、简约突变数以及计算变异位点比例。使用MEGA X[30]对梭子蟹科23个物种线粒体基因组的13个PCGs进行单基因比对再串联，采用kimura 2-parameter模型计算各物种之间的遗传距离。
1.3 系统发育分析
选择短额琵琶蟹（Lyreidus brevifrons）为外群，使用MAFFT 7.505[26]将外群及23种梭子蟹的PCGs进行比对，比对后的数据通过Gblocks[31]去除不可靠的序列，并使用ModelFinde 2.2.0[32]估算最适的核苷酸替代模型。采用最大似然法（Maximum likelihood，ML）和贝叶斯推断法（Bayesian inference，BI）分析梭子蟹的进化关系。使用IQ-TREE 2.2.0[33]构建最大似然树，GTR+R4+F为最佳的替代模型，其中检验次数设置为
1000 ，依据自展概率（Bootstrap probability，BP）评估分枝节点的可靠性。同时，使用MrBayes 3.2.7[34]构建贝叶斯树，选择GTR+I+G+F模型，运行4条蒙特卡洛马尔夫链（Markov chain monte carlo，MCMC）2000000 代，抽样频率为1 000，摒弃25%老化样本，并计算后验概率（Posterior probability，PP）以评估分枝节点的可靠性。1.4 分歧时间估计
使用MEGA X[30]对23种梭子蟹的分歧时间进行估算，将13个PCGs进行单基因比对、串联，选择非脊椎动物密码子表，使用ModelFinde 2.2.0[32]估算最佳模型，共设置4个校准节点，分别是青蟹属（Scylla）的分化时间，橄榄青蟹（Scylla olivacea）的分化时间，美青蟹属（Callinecte）与蟳属（Charybdis）的分化时间，以及美青蟹属（Callinecte）与梭子蟹属（Portunus）的分化时间[35]。
2. 结果与分析
2.1 线粒体基因组特征
23种梭子蟹线粒体基因组均为双链环状结构，共编码37个基因，即13个PCGs、2个rRNAs和22个tRNAs。线粒体基因组全长介于
15510 ~16263 bp之间，其中蓝蟹的线粒体基因组最大，阿嘎光背蟹（Lissocarcinus arkati）的线粒体基因组最小（表1）。通过比较基因组排列模式发现，所有物种的基因顺序高度保守，未检测到基因重排现象，表明梭子蟹科物种线粒体基因组在进化过程中具有显著的结构稳定性（图1）。核苷酸组成分析显示，该科线粒体基因组普遍呈现AT偏好性，其中特兰克巴尔青蟹的AT含量最高（73.7%），而红星梭子蟹的AT含量最低（65.6%）。进一步通过核苷酸偏倚指数（AT-skew和GC-skew）评估碱基组成异质性，结果显示，除短浆蟹属中的底栖短桨蟹和少刺短桨蟹外，其余物种AT偏倚均为负值，表明T碱基占比略高于A碱基；所有物种的GC偏倚均为负值，表明C碱基占比高于G碱基。2.2 蛋白质编码基因分析
对梭子蟹科线粒体基因组的RSCU分析显示（图2），所有氨基酸均由2种或以上同义密码子编码，在非脊椎动物的64个遗传密码子中，共鉴定出28个高频使用密码子（RSCU>1.00）。这些高频密码子在第三碱基位点偏好使用A碱基和U碱基，其中15个密码子以U碱基结尾，13个以A碱基结尾，进一步分析发现，以A碱基或U碱基为第三碱基的密码子中仅存在3个例外情况：CUA[亮氨酸（Leu1），RSCU=0.91]、CCA[谷氨酰胺（Gln），RSCU=0.97]和AGU[丝氨酸（Ser1），RSCU=0.6]未达到高频密码子阈值。
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图 2 梭子蟹科物种线粒体基因组密码子RSCU分布情况Figure 2. RSCU distribution of mitochondrial genome codon in Portunidae为明确蛋白编码基因在不同梭子蟹间的保守程度，分析了PCGs的进化速率，结果显示13个PCGs的Ka/Ks值均小于1，表明所有PCGs都受到纯化选择，但不同基因的进化速率不同（图3）。13个PCGs的进化速率顺序由慢到快依次为cox3 < cytb < cox1 < cox2 < atp6 < nad1 < nad5 < nad3 < nad4L < nad4 < nad2 < nad6 < atp8。在梭子蟹科中，Ka/Ks值最低的为cox3基因（0.006 6），表明其承受较强的纯化选择压力，相对保守；atp8基因（
0.1675 ）的Ka/Ks值最高，其承受较弱的选择压力。![]()
图 3 梭子蟹科物种线粒体基因选择压力分析Figure 3. Selection pressure analysis of mitogenome in Portunidae2.3 分子标记筛选与评估
对23种梭子蟹线粒体基因的核苷酸多态性分析表明，不同基因的保守性存在显著差异（表2），cox1基因保守性最强，其核苷酸变异率仅为38.32%，是唯一变异率低于40.00%的基因，而nad2基因多态性水平最高，变异率达65.60%。从序列特征来看，nad5基因总位点数最多（
1723 bp），其次是cox1（1532 bp）、nad4（1335 bp）和rrnL（1262 bp）。变异位点数排名前3的基因依次为nad5（947个）、nad4（720个）和rrnL（681个）。由于nad5、nad4和rrnl 3个基因具备较长的长度、较多的差异位点数以及较高的变异位点比例，因此它们可作为梭子蟹科物种快速鉴定的理想分子标记。表 2 梭子蟹科物种线粒体基因的差异分析Table 2. Differential analysis of mitochondrial genes in Portunidae参数
Parameters基因名称 Gene names atp6 atp8 cox1 cox2 cox3 cytb nad1 nad2 nad3 nad4 nad4L nad5 nad6 rrnL rrnS 总位点数*
Total number of sites671 159 1532 685 784 1135 929 1003 348 1335 303 1723 506 1262 737 保守位点数
Invariable sites352 59 945 387 446 641 475 345 164 615 146 776 187 581 361 变异位点数
Variable sites319 100 587 298 338 494 454 658 184 720 157 947 319 681 376 单现突变数
Singleton variable sites53 11 67 28 48 73 77 92 23 103 34 152 42 158 99 简约突变数
Parsimony informative sites266 89 520 270 290 421 377 566 161 617 123 795 277 523 277 变异位点比例/%
Ratio of variable sites47.54 62.89 38.32 43.50 43.11 43.52 48.87 65.60 52.87 53.93 51.82 54.96 63.04 53.96 51.02 注：*总位点数不包含缺失位点。 Notes:*The total number of sites does not include missing sites. 2.4 遗传距离分析
基于核苷酸序列的遗传距离分析表明，梭子蟹物种间的遗传分化程度存在显著差异（图4）。刺腕短桨蟹与钝齿短桨蟹之间的遗传距离最小（0.06），而最大遗传距离（0.35）出现在红星梭子蟹与蓝蟹之间，以及整洁短桨蟹与远海梭子蟹之间，表明跨属物种的遗传分化显著高于属内物种。在短桨蟹属内部，遗传距离呈现明显的聚类，刺腕短桨蟹、底栖短桨蟹、少刺短桨蟹和钝齿短桨蟹之间的遗传距离较小（0.06~0.13），提示这四者可能具有较近的进化关系；上述4个物种与双额短桨蟹和整洁短桨蟹的遗传距离显著增大（0.20~0.24），表明短桨蟹属内部分类群的遗传结构存在显著异质性。值得注意的是，双额短桨蟹与蟳属物种的遗传距离（0.17~0.21），甚至低于其与同属部分物种的遗传距离（0.20~0.24），暗示其分类地位或需结合形态学证据进一步验证。
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图 4 梭子蟹科物种线粒体基因组13个PCGs遗传距离Figure 4. Genetic distance of 13 protein-coding genes of mitogenome in Portunidae2.5 系统发育分析
基于13个PCGs的核苷酸序列，本研究构建了梭子蟹科的BI和ML。结果显示，2种方法构建的系统发育树拓扑结构一致（图5），纤手梭子蟹和拥剑梭子蟹形成了1个独立的分支，并呈现姊妹群关系，表明它们具有较近的共同祖先。此外，梭子蟹属与美青蟹属也表现出较近的亲缘关系，2种系统发育树均未支持短浆蟹属的单系性，短浆蟹属中的双额短桨蟹并未与同属物种形成聚类，而是和蟳属关系更近。在支持率方面，贝叶斯树的表现相对较高，除缺少阿嘎光背蟹与其他物种分化的支持率，以及环纹蟳和钝齿蟳间的后验概率为0.794外，其他支持率均在0.9以上，表明大部分分支关系具有较高的可靠性。ML的支持结果与BI基本一致，不同属间分化的支持率普遍较高，但蟳属内部物种分化的支持率相对较低，提示该属内部的系统发育关系可能存在一定的不确定性。
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图 5 基于13个PCGs核苷酸序列构建的梭子蟹科贝叶斯树（BI）和最大似然树（ML）Figure 5. Phylogenetic tree of Portunidae inferred from the nucleotide sequences of 13 PCGs based on Bayesian inference (BI) and maximum likelihood (ML) analysis2.6 分歧时间估算
基于分子钟分析（图6），梭子蟹科的起源可追溯至三叠系，其中阿嘎光背蟹与其他梭子蟹的分化时间约为2.065亿万年前。青蟹属的分支形成于0.965亿万年前，其内部物种的分歧时间集中于0.251~0.529亿万年前，表明该属在古近纪经历了显著的物种分化。纤手梭子蟹与拥剑梭子蟹的分歧时间为0.787亿万年前。美青蟹属与梭子蟹属的分化发生于0.600亿万年前。蟳属于0.464亿万年前与其他梭子蟹类群分离，其内部物种分化呈现阶段性特征，锈斑蟳与双斑蟳的分歧时间约为0.378亿万年前，而钝齿蟳与环纹蟳的分化较晚（0.253亿万年前），表明蟳属的物种形成具有阶段性特征。在分析的23种梭子蟹中，刺腕短桨蟹与钝齿短桨蟹的分化最晚（0.073亿万年前），且二者是新近系中唯一发生分化的梭子蟹物种。分歧时间估算揭示了梭子蟹科自三叠系至新近系跨越约2亿万年的演化历史。
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图 6 梭子蟹科物种分歧时间估算注：数字代表节点的中间值及95%的置信区间。Figure 6. Estimation of divergence time in PortunidaeNote:The numbers represent posterior medians and 95% posterior interval value.3. 讨论
3.1 梭子蟹线粒体基因组特征
本研究通过对23种梭子蟹线粒体基因组的比较分析发现，其基因组均由13个PCGs、2个rRNAs和22个tRNAs组成，且基因排列模式与短尾次目祖先物种高度一致[36]，未检测到基因重排现象。这一发现进一步证实了梭子蟹线粒体基因组在进化过程中具有显著的结构保守性。短尾次目物种普遍存在基因重排现象，研究显示在已测序的113个短尾类物种中已鉴定出15种不同的基因排列模式[37]，其中淡水蟹的线粒体基因重排也较频繁，例如雅安华溪蟹（Sinopotamon yaanense）和扬子华溪蟹（Sinopotamon yangtsekiense）的线粒体基因组中，trnM-nad2trnW-trnC-trnY基因簇及trnQ基因均发生显著易位[38]。梭子蟹基因组的保守性可能与其对海洋环境具有较高的适应性，以及高效的线粒体复制修复机制有关。此外，在碱基组成上，23种梭子蟹线粒体基因组表现出显著的AT偏好性，与后生动物线粒体基因的一般规律相符[13]，如对虾科[39]和长臂虾科[40]物种均含有较高的A碱基和T碱基。同义密码子相对使用度分析进一步揭示，梭子蟹PCGs在第三位密码子上显著偏好AT碱基。这一特征与十足目类群[如白纹方蟹 （Grapsus albolineatus）[41]等]的进化策略一致，可能通过优化tRNA丰度与密码子的匹配效率来提升翻译速率。
选择压力分析（Ka/Ks值）是评估基因进化保守性的重要指标[42]。本研究发现，梭子蟹13个PCGs的Ka/Ks值均显著低于1，表明所有基因在进化过程中均受到强烈的纯化选择作用。这一现象与海洋生物线粒体基因的普遍进化模式一致，例如闪电涡螺（Fulgoraria rupestris）的PCGs同样表现出显著的纯化选择特征[43]。cox3、cytb和cox1基因的Ka/Ks值相近且较低，表明这些基因更倾向于保持其原始功能，避免发生有害突变。相较而言，atp8基因的Ka/Ks值明显高于其他基因，表明其承受的纯化选择压力相对较弱，这一特征可能与其功能冗余性相关，并可部分解释该基因在某些后生动物线粒体基因组中的缺失现象[44]。本研究通过比较梭子蟹线粒体基因组，为解析不同物种间的遗传多样性提供依据。
3.2 梭子蟹分子标记
梭子蟹在进化学及生物地理学研究中占有重要地位[45-46]，选择恰当的分子标记对于确保研究准确性至关重要。目前，梭子蟹科物种的分子标记主要有28S rRNA、16S rRNA和cox1基因。如迟大利等[47]借助cox1和16S rRNA线粒体基因对紫色和茶绿色三疣梭子蟹判定亲缘关系。然而，已有研究指出，尽管cox1基因适用于甲壳纲动物的分类鉴定，但在科级及其以下分类层次上，难以有效区分亲缘关系密切的物种[48]。基于此，本研究对23种梭子蟹的13个PCGs和2个rRNA基因进行了差异位点分析。结果表明，nad5、nad4和rrnL基因不仅长度较长，而且差异位点多，变异位点比例高，因而可以被用于分析梭子蟹科不同物种和群体之间的生物多样性，是梭子蟹科物种快速鉴定较为理想的分子标记。此前，蟹类的鉴定和分类主要使用16SrRNA和cox1等线粒体基因片段[1]，但本研究发现，尽管cox1基因的长度较长，但其差异位点较少，变异位点比例低，甚至是最保守的基因，因此不建议将其作为梭子蟹科群体遗传学研究的分子标记。
3.3 梭子蟹科系统发育与分歧时间
本研究基于13个PCGs，使用ML和BI构建的系统发育树拓扑结构一致，并具有较高的置信度。本结果与前人的研究基本一致，例如Ma等[20]基于12个PCGs探究了十足目物种系统发育关系，证实了青蟹属为单系群，梭子蟹属和美青蟹属互为姐妹关系。Cubelio等[18]利用cox1基因构建最大似然树，支持光背蟹属、单梭蟹属、狼牙蟹属、蟳属的单系性。此外，本研究发现，短浆蟹属为非单系群，具体而言，双额短桨蟹与蟳属的关系更密切，可能是因为它们同属短桨蟹亚科，且在形态上极为相似，特别是螯足均长有四根刺[17]；前人研究也指出，短浆蟹属蟹类内部形态上仍存在较大差异，系统发育分析也证实了短浆蟹属中的部分物种与蟳属聚为同一分支[2]。此外，遗传距离分析的结果亦与进化树保持一致，尤其是双额短桨蟹与其同属物种间遗传距离较大，与蟳属成员间的遗传距离则相对较小。为进一步验证双额短桨蟹的分类地位，未来需结合传统分类学、生物地理学等多学科手段进行分析。
目前，关于梭子蟹科分歧时间的估算研究较少，仅有个别物种被预测。本研究对23种梭子蟹展开了分歧时间估算，结果显示梭子蟹科的起源至少可以追溯到三叠系，现存物种大多分化于古近纪。青蟹属与梭子蟹属的分化时间发生在0.965亿万年前，符合Yang等[35]约1.000亿万年前的估算。此外，蓝蟹在0.600亿万年前的分化时间与Sun等[49]的估算相近。生命进化时间信息公共知识库（http://www.timetree.org/）记录了特兰克巴尔青蟹和锯缘青蟹于0.278亿万年前分化，而本研究预测的分化时间为0.315亿万年前。综上所述，本研究得出的分子钟结果与已有研究高度一致，且分歧时间的置信区间与以往分析结果大致重合，表明此次分子钟估算具备较高的可靠性。
4. 结论
本研究对23种梭子蟹线粒体基因组分析表明：1）线粒体基因组成具有高度结构稳定性，未检测到基因重排现象，其基因排列模式与短尾次目祖先物种一致。基因组呈现显著的AT偏好性，且PCGs第三位密码子偏好使用A碱基和U碱基，13个PCGs均受到纯化选择作用。2）nad5、nad4和rrnl基因因具有较长的序列长度及较高的变异位点比例，可被作为梭子蟹科物种快速鉴定的高效分子标记。相较于传统标记cox1基因，上述基因在近缘物种区分中更具分辨力。3）基于13个PCGs构建的系统发育树支持短浆蟹属的非单系性，其中双额短桨蟹与蟳属物种具有较近的亲缘关系，且得到遗传距离支持。此外，梭子蟹科的起源至少可追溯至三叠纪，现存类群的分化主要发生于古近纪。
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图 2 梭子蟹科物种线粒体基因组密码子RSCU分布情况
Figure 2. RSCU distribution of mitochondrial genome codon in Portunidae
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图 3 梭子蟹科物种线粒体基因选择压力分析
Figure 3. Selection pressure analysis of mitogenome in Portunidae
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图 4 梭子蟹科物种线粒体基因组13个PCGs遗传距离
Figure 4. Genetic distance of 13 protein-coding genes of mitogenome in Portunidae
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图 5 基于13个PCGs核苷酸序列构建的梭子蟹科贝叶斯树（BI）和最大似然树（ML）
Figure 5. Phylogenetic tree of Portunidae inferred from the nucleotide sequences of 13 PCGs based on Bayesian inference (BI) and maximum likelihood (ML) analysis
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图 6 梭子蟹科物种分歧时间估算
注：数字代表节点的中间值及95%的置信区间。
Figure 6. Estimation of divergence time in Portunidae
Note:The numbers represent posterior medians and 95% posterior interval value.
表 1 梭子蟹科物种线粒体基因组的基本特征
Table 1 Basic characteristics of mitogenome of Portunidae
属
Genera种名
SpeciesGenBank接收号
GenBank accession number长度/bp
LengthAT含量/%
AT contentAT偏倚
AT-skewGC偏倚
GC-skew短浆蟹属
Thalamita刺腕短桨蟹
Thalamita spinicarpaNC_069015.1 15 783 69.2 −0.018 −0.227 底栖短桨蟹
Thalamita prymnaNC_069014.1 15 807 68.7 0.011 −0.269 整洁短桨蟹
Thalamita integraNC_069013.1 15 773 66.7 −0.039 −0.188 少刺短桨蟹
Thalamita danaeNC_069012.1 15 809 69.9 0.004 0.272 双额短桨蟹
Thalamita simaNC_039640.1 15 831 71.7 −0.016 −0.242 钝齿短桨蟹
Thalamita crenataNC_024438.1 15 787 69.7 −0.013 −0.240 蟳属
Charybdis环纹蟳
Charybdis annulataNC_069011.1 15 747 67.8 −0.014 −0.269 钝齿蟳
Charybdis helleriiNC_060621.1 15 913 70.2 −0.038 −0.252 双斑蟳
Charybdis bimaculataNC_037695.1 15 714 71.6 −0.051 −0.194 善泳蟳
Charybdis natatorNC_036132.1 15 664 70.4 −0.034 −0.253 锈斑蟳
Charybdis feriataNC_024632.1 15 660 70.2 −0.028 −0.246 日本蟳
Charybdis japonicaNC_013246.1 15 738 69.2 −0.024 −0.228 光背蟹属
Lissocarcinus阿嘎光背蟹
Lissocarcinus arkatiNC_057302.1 15 510 67.2 −0.012 −0.311 狼牙蟹属
Lupocycloporus纤手梭子蟹
Lupocycloporus gracilimanusNC_040124.1 15 990 69.7 −0.024 −0.258 单梭蟹属
Monomia拥剑梭子蟹
Monomia gladiatorNC_037173.1 15 878 69.0 −0.034 −0.242 梭子蟹属
Portunus红星梭子蟹
Portunus sanguinolentusNC_028225.1 16 024 65.6 −0.037 −0.250 远海梭子蟹
Portunus pelagicusNC_026209.1 16 157 68.7 −0.019 −0.219 三疣梭子蟹
Portunus trituberculatusNC_005037.1 16 026 70.2 −0.051 −0.241 青蟹属
Scylla拟曼赛因青蟹
Scylla paramamosainNC_012572.1 15 825 73.0 −0.047 −0.247 橄榄青蟹
Scylla olivaceaNC_012569.1 15 723 69.4 −0.035 −0.267 特兰克巴尔青蟹
Scylla tranquebaricaNC_012567.1 15 833 73.7 −0.047 −0.247 锯缘青蟹
Scylla serrataNC_012565.1 15 775 72.6 −0.047 −0.242 美青蟹属
Callinectes蓝蟹
Callinectes sapidusNC_006281.1 16 263 69.1 −0.011 −0.279 
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表 2 梭子蟹科物种线粒体基因的差异分析
Table 2 Differential analysis of mitochondrial genes in Portunidae
参数
Parameters基因名称 Gene names atp6 atp8 cox1 cox2 cox3 cytb nad1 nad2 nad3 nad4 nad4L nad5 nad6 rrnL rrnS 总位点数*
Total number of sites671 159 1532 685 784 1135 929 1003 348 1335 303 1723 506 1262 737 保守位点数
Invariable sites352 59 945 387 446 641 475 345 164 615 146 776 187 581 361 变异位点数
Variable sites319 100 587 298 338 494 454 658 184 720 157 947 319 681 376 单现突变数
Singleton variable sites53 11 67 28 48 73 77 92 23 103 34 152 42 158 99 简约突变数
Parsimony informative sites266 89 520 270 290 421 377 566 161 617 123 795 277 523 277 变异位点比例/%
Ratio of variable sites47.54 62.89 38.32 43.50 43.11 43.52 48.87 65.60 52.87 53.93 51.82 54.96 63.04 53.96 51.02 注：*总位点数不包含缺失位点。 Notes:*The total number of sites does not include missing sites.
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