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国外已经在病毒的细胞培养、组织病理学、RT-PCR、nested RT-PCR、semi-nested RT-PCR、SYBR quantitative RT-PCR、原位杂交等检测技术方面进行了研究,并建立了相应的检测方法。因为分子生物学方法具有快速、灵敏、简便的特点,大多数国家都采用其对TiLV进行监测和诊断。现有检测TiLV的分子生物学方法大多是针对假设蛋白基因片段而建立,如Tsofack J K等[5]根据基因片段3(Genebank序列号KJ605629)建立了巢氏RT-PCR方法;Dong H T等[6]建立的半巢氏RT-PCR方法也是根据片段3建立的;Pitchaporn W等[7]建立的实时荧光定量RT-PCR(Reverse transcription-quantitative real-time PCR,RT-qPCR)方法根据片段3设计引物探针,GenBank序列号为KU751816.1、MF574205.1、MF582636.1、MF502419.1、KX631923.1;刘助红等[8]同样是根据基因片段3(Genebank序列号KJ605629)建立了RT-LAMP方法。TiLV基因片段3编码假设蛋白,基因片段1编码RNA聚合酶,目前已有大量关于基因片段3的研究论文,但通过基因片段1进行检测的研究论文很少。本研究根据TiLV基因片段1的保守序列设计3套特异性引物和探针,并探讨建立RT-qPCR方法的可行性,为进一步监控及预防TiLV提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品的采集和处理
采集罗非鱼成鱼的肝、脾、肾和脑组织,并于-80℃冻存备用。
1.1.2 主要试剂和仪器
主要试剂:MagSi Total RNA Kit,OMEGA公司产品,货号M7930-02;QuantiNova Probe RT-PCR Kit,QIAGEN公司产品,货号为208354,包括2×Probe RT-PCR Master Mix、QN Probe RT-Mix、RNase-free water。
主要仪器:荧光定量PCR仪(德国耶拿,型号qTOWER3G)、磁珠纯化系统(杭州奥盛,型号Auto-Pure32A)、台式冷冻离心机(Beckman公司,型号Allegra64R)。
1.1.3 引物
检测TiLV的RT-qPCR的引物和探针:
引物TiLV-qF:5’-CCCACTTACACAACGAGGAATGA-3’(5 μmol/L);
引物TiLV-qR:5’-GGTGGCAATCCCAAGTCAGTAG-3’(5 μmol/L);
探针TiLV-qP:VIC-CTCCCCACATGCCTG-MGB(5 μmol/L)。
1.1.4 扩增片段基因序列(97 bp)
扩增片段基因序:cccacttacacaacgaggaatgaggacttcctccccacatgcctgggagggaagactgtaattagctttcaatctctact gacttgggattgccacc。
合成的TiLV的标准质粒和慢病毒序列相同(976 bp),均包含该97 bp扩增片段基因序列。
1.1.5 反应体系
若无特殊说明,均按照表1反应体系进行试验。
表1 反应体系
Tab.1
| 成分 Composition | 2×Probe RT-PCR Master Mix | QN Probe RT-Mix | 引物TiLV-qF Primer | 引物TiLV-qR Primer | 探针TiLV-qP Probe | 模板 Model | RNase-free water |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 体积/μL Volume | 10 | 0.2 | 1 | 1 | 1 | 1 | 补充至20 |
1.1.6 反应条件
反应条件:反转录45℃ 20 min;预变性95℃ 5 min;扩增95℃ 15 s,退火延伸温度 1 min,40个循环。荧光收集设置在退火延伸时进行。若无特殊说明,均按照此反应条件进行试验。
1.1.7 核酸浓度
本文使用到的核酸浓度:TiLV质粒,5 ng/μL;TiLV慢病毒,25 ng/μL。
1.2 方法
1.2.1 RNA的提取
按照MagSi Total RNA Kit操作说明书进行RNA提取。
1.2.2 检测TiLV的RT-qPCR方法的建立及优化
1)检测TiLV的RT-qPCR的引物、探针的最佳浓度研究
将原始浓度为5 μmol/L的探针TiLV-qP、原始浓度为10 μmol/L的引物TiLV-qF和TiLV-qR,分别进行10倍梯度稀释。
A组:6个荧光定量PCR管中均加入使用浓度为5 μmol/L的探针TiLV-qP 1 μL(对应的终浓度0.25 μmol/L),A1~A6管分别加入使用浓度分别为10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5 μmol/L的引物TiLV-qF和TiLV-qR各1 μL(对应的终浓度分别为0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625 μmol/L);B组:6个荧光定量PCR管中均加入使用浓度为2.5 μmol/L 的探针TiLV-qP 1 μL(对应的终浓度为0.125 μmol/L),B1~B6管分别加入使用浓度分别为10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5 μmol/L的引物TiLV-qF和TiLV-qR各1 μL;C组:6个荧光定量PCR管中均加入使用浓度为1.25 μmol/L 的探针TiLV-qP 1μL(对应的终浓度为0.062 5 μmol/L),C1~C6管分别加入使用浓度分别为10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5 μmol/L的引物TiLV-qF和TiLV-qR各1 μL;D组:6个荧光定量PCR管中均加入使用浓度为0.625 μmol/L 的探针TiLV-qP 1 μL(对应的终浓度为0.031 25 μmol/L),D1~D6管分别加入使用浓度分别为10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5 μmol/L的引物TiLV-qF和TiLV-qR各1 μL(表2)。反应条件按照1.1.6进行。
表2 检测TiLV的RT-qPCR的引物探针最佳浓度各组分情况表
Tab.2
| 组别 Group | 成分Composition | ||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 2×Probe RT-PCR Master Mix/μL | QN Probe RT-Mix/ μL | 引物TiLV-qF | 引物TiLV-qR | 探针TiLV-qP | 模板/μL Model | RNase-free water/μL | |||||
| 浓度/(μmol/L) Concentration | 体积/μL Volume | 浓度/(μmol/L) Concentration | 体积/μL Volume | 浓度/(μmol/L) Concentration | 体积/μL Volume | ||||||
| A1 | 10 | 10 | |||||||||
| A2 | 5 | 5 | |||||||||
| A | A3 | 10 | 0.2 | 2.5 | 1 | 2.5 | 1 | 5 | 1 | 1 | 5.8 |
| A4 | 1.25 | 1.25 | |||||||||
| A5 | 0.625 | 0.625 | |||||||||
| A6 | 0.312 5 | 0.312 5 | |||||||||
| B1 | 10 | 10 | |||||||||
| B2 | 5 | 5 | |||||||||
| B | B3 | 10 | 0.2 | 2.5 | 2.5 | 1 | 2.5 | 1 | 1 | 5.8 | |
| B4 | 1.25 | 1.25 | |||||||||
| B5 | 0.625 | 0.625 | |||||||||
| B6 | 0.312 5 | 0.312 5 | |||||||||
| C1 | 10 | 10 | |||||||||
| C2 | 5 | 5 | |||||||||
| C | C3 | 10 | 0.2 | 2.5 | 1 | 2.5 | 1 | 1.25 | 1 | 1 | 5.8 |
| C4 | 1.25 | 1.25 | |||||||||
| C5 | 0.625 | 0.625 | |||||||||
| C6 | 0.312 5 | 0.312 5 | |||||||||
| D1 | 10 | 10 | |||||||||
| D2 | 5 | 5 | |||||||||
| D | D3 | 10 | 0.2 | 2.5 | 1 | 2.5 | 1 | 0.625 | 1 | 1 | 5.8 |
| D4 | 1.25 | 1.25 | |||||||||
| D5 | 0.625 | 0.625 | |||||||||
| D6 | 0.312 5 | 0.312 5 | |||||||||
2)检测TiLV的RT-qPCR方法的最佳退火温度和重复性研究
将原始浓度为5 μg/mL的TiLV质粒进行10倍梯度稀释,依次为5×10-2~5×10-7 μg/mL。除了模板外,其他按照优选的反应体系配制试剂,将按梯度稀释的TiLV质粒分装到6组(每组重复3次)共18个荧光PCR反应管中。
第1组至第6组的荧光PCR反应管分别加入5×10-2~5×10-7 ng/μL梯度稀释的TiLV质粒各1 μL。第1~6组分别按照退火温度50、55、60、65、70℃进行RT-qPCR。反应条件:反转录45℃ 20 min;预变性95℃ 5 min;扩增95℃ 15 s,退火延伸温度分别为50、55、60、65、70℃1 min,40个循环。荧光收集设置在50、55、60、65、70℃退火延伸时进行。
1.2.3 绘制检测TiLV的RT-qPCR方法的标准曲线
除模板按照优选的反应体系配制试剂外,其余将原始浓度为5 μg/mL的TiLV质粒进行10倍梯度稀释,分别为5×10-1~5×10-6 μg/mL,并分装到6组(每组重复4次)共24个荧光PCR反应管中,添加体积为1 μL。反应条件按照1.1.6(其中,退火延伸温度根据1.2.2试验获得)进行。最后绘制检测TiLV的RT-qPCR方法的标准曲线。
1.2.4 检测TiLV的RT-qPCR方法的灵敏度试验
除了模板按照优选的反应体系配制试剂外,其余将原始浓度为5 μg/mL的TiLV质粒进行10倍梯度稀释,分别为5×10-1~5×10-8 μg/mL,平均分装到8个荧光PCR反应管中,添加体积为1 μL(TiLV质粒终浓度分别为2.5×10-2~2.5×10-9 ng/μL)。反应条件按照1.1.6(其中,退火延伸温度根据1.2.2试验获得)进行。
1.2.5 检测TiLV的RT-qPCR方法的特异性试验
按照优选的反应体系(模板除外)配制试剂,平均分装到13个荧光PCR反应管中,第1~13管分别加入TiLV质粒、TiLV慢病毒、真鲷虹彩病毒(RSIV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、流行性造血器官坏死病毒(EHNV)、金鱼造血器官坏死病毒(GFHNV)、流行性溃疡综合征(EUS)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、传染性鲑鱼贫血病(ISA)、鲑鱼甲病毒(SAV)、病毒性出血性败血症(VHSV)、RNase-free water各1 μL。反应条件按照1.1.6(其中,退火延伸温度根据1.2.2试验获得)进行。
1.2.6 应用
将建立的检测TiLV的RT-qPCR方法应用于300份罗非鱼、石斑鱼等样品的TiLV的检测。罗非鱼临床样品从福建省养殖场采集,包括诏安县梅川双田水库养殖场、漳州市常山基祥水产养殖场、诏安县红坑水库养殖场、福建铭兴食品冷冻有限公司四都水库养殖场、三姑娘水库养殖场、岭下溪水库养殖场、石厝底水库养殖场、梅州水库养殖场。石斑鱼样品来自本实验室日常检疫留样。
2 结果与分析
2.1 检测TiLV的RT-qPCR方法的优化
图1
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图1
RT-qPCR 的引物探针最佳浓度的探究
注:A~C的TiLV-qP终浓度分别为0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 μmol/L(对应的使用浓度分别为5、2.5、1.25、0.625 μmol/L) ;A1~A6、B1~ B6、C1~C6、D1~ D6的 TiLV-qF/qR终浓度分别为0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625 μmol/L(对应的使用浓度分别为10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5 μmol/L)。
Fig.1
Research on optimal concentration of RT-qPCR
Notes:The TiLV-qP final concentrations of A ~ C were respectively 0.25,0.125,0.062 5 and 0.031 25 μmol/L(corresponding working concentrations were 5,2.5,1.25 and 0.625 μmol/L,respectively).The TiLV-qF /qR final concentrations of A1 ~ A6,B1~ B6,C1~C6 and D1~ D6 were respectively 0.5,0.25,0.125,0.062 5,0.031 25 and 0.015 625 μmol/L(corresponding working concentrations were 10,5,2.5,1.25,0.625,0.312 5 μmol/L,respectively).
图2
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图2
RT-qPCR 的退火温度和重复性的探究
注:A~E的退火温度分别为50、55、60、65、70℃。1~6代表加入反应体系中的质粒初始浓度(5×10-1~5×10-6 ng/μL)。
Fig.2
Research on annealing temperature and repeatability of RT-qPCR
Notes:The annealing temperatures of A ~ E were 50,55,60,65 and 70℃,respectively.Curve 1~6 represented the initial concentration of plasmids in the reaction system(5×10-1~5×10-6 ng/μL).
图2试验结果显示,退火温度55~60℃,同等核酸浓度扩增曲线Ct值基本一致,且重复性好;退火温度65~70℃,灵敏度降低。通常荧光PCR退火温度选择60℃,因此本RT-qPCR最佳退火温度选择60℃,且重复性好。
2.2 检测TiLV的RT-qPCR方法的标准曲线
图3
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图3
RT-qPCR 的标准曲线的探究
注:1~6的TiLV质粒终浓度分别为2.5×10-2~2.5×10-7 ng/μL(对应的质粒使用浓度为5×10-1~5×10-6 ng/μL)。
Fig.3
Research on standard curve of RT-qPCR
Notes:The final concentrations of TiLV plasmids from 1 to 6 were respectively 2.5× 10-2~2.5 ×10-7 ng/μL(the corresponding plasmids were respectively 5× 10-1~5×10-6 ng/μL).
2.3 检测TiLV的RT-qPCR方法的灵敏度分析
图4
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图4
RT-qPCR 的灵敏度的探究
注:1~8的TiLV质粒终浓度分别为2.5×10-2~2.5×10-9ng/μL(对应的使用浓度分别为5×10-1~5×10-8 ng/μL)。
Fig.4
Research on sentivity of RT-qPCR
Notes:The final concentrations of TiLV plasmids of 1-8 were respectively 2.5× 10-2~2.5×10-9 ng/μL(the corresponding working concentrations were 5× 10-1~5×10-8 ng/μL).
2.4 检测TiLV的RT-qPCR方法的特异性分析
特异性结果见图5。试验结果显示本文建立的检测TiLV的RT-qPCR方法只能扩增出TiLV质粒和TiLV慢病毒,其他常见的水生动物病毒均无扩增曲线,说明该方法特异性好。
图5
RT-qPCR方法的建立_files/img_5.png)
图5
RT-qPCR 特异性试验
注:1.TiLV质粒;2.TiLV慢病毒;3.真鲷虹彩病毒(RSIV);4.锦鲤疱疹病毒(KHV);5.流行性造血器官坏死病毒(EHNV);6.金鱼造血器官坏死病毒(GFHNV);7.流行性溃疡综合征(EUS);8.鲤春病毒血症病毒(SVCV);9.传染性造血器官坏死病毒(IHNV);10.传染性鲑鱼贫血病(ISA);11.鲑鱼甲病毒(SAV);12.病毒性出血性败血症(VHSV);13.阴性对照。
Fig.5
Specificity test of RT-qPCR
Notes:1.TiLV plasmid;2.TiLV lentivirus;3.Red sea bream irido virus;4.Koi herpes virus;5.Epizootic haematopoietic necrosis virus;6.Goldfish haematopoietic necrosis virus;7.Epizootic ulcerative syndrome;8.Spring viremia of carp virus;9.Infectious haematopoietic necrosis virus;10.Infectious salmonid alphavirus;11.Salmonid alphavirus;12.Viral haemorrhagic septicaemia virus;13.Negative control.
2.5 检测TiLV的RT-qPCR方法的验证与应用
将本试验建立的检测TiLV的RT-qPCR方法应用于300份日常检测样品及水库样品的检测,结果均未检出TiLV。 并采用本团队建立的同时检测TiLV和病毒性神经坏死病毒(Viral nervous necrosis virus,VNNV)的双重RT-PCR方法和检测TiLV的RT-LAMP方法进行验证,显示三种方法对所有样品的检测结果均一致,均未检出TiLV。
3 讨论
3.1 TiLV基因分析
TiLV共10个基因片段,基因片段1编码RNA聚合酶,基因片段2~10编码假设蛋白,与以往的蛋白没有相似性,因此其功能不明确[7]。目前本研究团队从Genbank中查询到31个TiLV病毒毒株的基因片段1的序列,包括毒株TH-2013、TH-2014、TH-2015、TH-2016-CN、TH-2016-CU、TH-2017、TH-2018-K、TH-2018-N、TH-2019、BD-2017、BD-2017-181、BD-2019-E3、BD-2019-E1、WVL18053-01A、WVL19031-01A、WVL19054、CL、F3-4、TV1、TV2、TV3、TV4、TV5、TV6、TV7、Til-4-2011(基因片段1的GenBank登录号:NC_029926、KU751814)、NBC02、NBC03、NBC04、NBC06、EC-2012)。本文根据基因片段1的保守序列,设计3套引物和探针,并从中优选出引物和探针的最佳浓度。
3.2 国内TiLV监测情况
全国水产技术推广总站每年都进行TiLV的专项检测工作,海关系统也有TiLV的专项监测任务,本实验室参与了福建省水产技术推广总站采样和病毒检测工作,至今未检出一例,其他地区也未有报道。
本实验室自2017年就开始收集罗非鱼样品,至今已收集300多份,利用本文建立的RT-qPCR方法检测,结果均为阴性。但这并不能说该方法无效,综合文献报道及每年海关、水产技术推广站的监测结果,研究团队认为目前国内罗非鱼感染TiLV的可能性极低,但监控预防工作不可松懈。
4 结论
本文建立了检测TiLV的RT-qPCR方法,优化的20 μL反应体系包括:2×Probe RT-PCR Master Mix 10 μL,QN Probe RT-Mix 0.2 μL,5 μmol/L的引物TiLV-qF、TiLV-qR、探针TiLV-qP各1 μL,模板1 μL,补充RNase-free water至20 μL;优化的反应条件:反转录45℃ 20 min;预变性95℃ 5 min;扩增95℃ 15 s,60℃ 1 min,40个循环;荧光收集设置在60℃退火延伸时进行。该方法能够检测出TiLV质粒和TiLV慢病毒,对其他病毒无扩增条带,说明方法特异性好,灵敏度为2.5×10-8 ng/μL。
参考文献
罗非鱼供给侧结构改革的思考
[J].RT-qPCR方法的建立_files/more.jpg)
为了提高罗非鱼养殖的三大效益，总结了罗非鱼产业供给侧存在的突出问题如供需失衡、生产成本持续上涨、市场结构单一，抗风险能力小等，分析其成因包括中国罗非鱼主要依赖出口市场，出口消费不景气、加工厂盲目扩大产能，产品附加值低等。笔者从罗非鱼苗种生产、成鱼养殖，产品加工和出口贸易四个产业主要环节概述了中国罗非鱼产业生产现状，提出了罗非鱼供给侧结构改革的技术经济与政策路径，即通过推广健康养殖模式、加强加工产品关键配套技术研发、加大产品质量安全检测力度、开拓国内市场和大力发展产业化经营组织等措施，以促进罗非鱼产业的健康可持续发展。
Identification of a novel RNA virus lethal to tilapia
[J].Tilapines are important for the sustainability of ecological systems and serve as the second most important group of farmed fish worldwide. Significant mortality of wild and cultured tilapia has been observed recently in Israel. The etiological agent of this disease, a novel RNA virus, is described here, and procedures allowing its isolation and detection are revealed. The virus, denominated tilapia lake virus (TiLV), was propagated in primary tilapia brain cells or in an E-11 cell line, and it induced a cytopathic effect at 5 to 10 days postinfection. Electron microscopy revealed enveloped icosahedral particles of 55 to 75 nm. Low-passage TiLV, injected intraperitoneally in tilapia, induced a disease resembling the natural disease, which typically presents with lethargy, ocular alterations, and skin erosions, with >80% mortality. Histological changes included congestion of the internal organs (kidneys and brain) with foci of gliosis and perivascular cuffing of lymphocytes in the brain cortex; ocular inflammation included endophthalmitis and cataractous changes of the lens. The cohabitation of healthy and diseased fish demonstrated that the disease is contagious and that mortalities (80 to 100%) occur within a few days. Fish surviving the initial mortality were immune to further TiLV infections, suggesting the mounting of a protective immune response. Screening cDNA libraries identified a TiLV-specific sequence, allowing the design of a PCR-based diagnostic test. This test enables the specific identification of TiLV in tilapines and should help control the spread of this virus worldwide. Copyright © 2014, American Society for Microbiology. All Rights Reserved.
Emergency response to emerging diseases:TiLV in tilapia
[EB/OL].[
Detection of tilapia lake virus in clinical samples by culturing and nested reverse transcription-PCR
[J].Tilapia are an important group of farmed fish that serve as a significant protein source worldwide. In recent years, substantial mortality of wild tilapia has been observed in the Sea of Galilee and in commercial ponds in Israel and Ecuador. We have identified the etiological agent of these mass die-offs as a novel orthomyxo-like virus and named it tilapia lake virus (TiLV). Here, we provide the conditions for efficient isolation, culturing, and quantification of the virus, including the use of susceptible fish cell lines. Moreover, we describe a sensitive nested reverse transcription-PCR (RT-PCR) assay allowing the rapid detection of TiLV in fish organs. This assay revealed, for the first time to our knowledge, the presence of TiLV in diseased Colombian tilapia, indicating a wider distribution of this emerging pathogen and stressing the risk that TiLV poses for the global tilapia industry. Overall, the described procedures should provide the tilapia aquaculture industry with important tools for the detection and containment of this pathogen.Copyright © 2017 American Society for Microbiology.
Emergence of tilapia lake virus in Thailand and an alternative semi-nested RT-PCR for detection
[J].
A TaqMan RT-qPCR assay for tilapia lake virus(TiLV)detection in tilapia
[J].
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表1RT-qPCR方法的建立_files/img_thumbnail_icon.jpg){kind=icon}
图1RT-qPCR方法的建立_files/1.png)
