藤茶学名为显齿蛇葡萄(Ampelopsis grossedentata),既能入药又可食用,民间用其嫩茎叶入茶已有数百年的历史,据《中草药汇编》等文献记载,藤茶入药有清热解毒的功效,可治感冒风热、咽喉肿痛等[1]。藤茶主要含有黄酮类、甾体类、萜类、多酚、多糖类等化学成分[2],其中二氢杨梅素(Dihydromyricetin,DMY)是藤茶的主要活性成分,化学式为3,5,7,3',4',5'-六羟基-2,3-双氢黄酮醇[3],能抑制细菌等微生物的生长[4],现代研究表明藤茶具有抗氧化、抑菌、提高免疫力、降血脂、清除自由基、抗血栓、抗肿瘤、消炎等作用[5]。现阶段关于藤茶粉及二氢杨梅素的提取工艺已经很成熟,但对藤茶及其黄酮类成分的生物活性研究基本限于体外试验,对体内的相关研究较少,而且对藤茶多途径、多靶点抗感染作用机制的研究不够深入[2]。藤茶的抗氧化活性近年来研究较多,涉及生物医药、食品行业、畜禽养殖等[6],但是在水产上的研究应用很少。目前,细菌性疾病是危害鱼类养殖的主要生物源疾病[7]。已报道的细菌病原微生物有维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、柱状黄杆菌(Flavobacterium cloumnare)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)等。其中维氏气单胞菌常引起水生动物腐皮病、烂尾病、细菌性败血症等多种病症[8],嗜水气单胞菌能够引起细菌性败血症[9]、急性肠胃炎[10]、皮肤溃烂等疾病[11],给我国水产养殖业造成严重的损失。在水产细菌疾病的防治中多采用抗生素进行治疗,而抗生素的过度使用易导致病原菌产生耐药性和水产品残留等问题[12],当水产细菌疾病暴发时再使用抗生素治疗效果也不好,还会污染水源、危害人们健康。藤茶对大肠杆菌、金色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌均有抑菌作用[13],二氢杨梅素对金黄色葡萄球菌、福氏志贺菌、铜绿假单胞菌、奇异变形杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、乙型副伤寒沙门菌和枯草芽孢杆菌均有抑制作用[14]。本试验探究藤茶粉和二氢杨梅素分别对维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌的体外抑菌效果,旨在证明藤茶粉和二氢杨梅素对这2种细菌有抑制作用,为藤茶粉和二氢杨梅素代替抗生素应用于水产细菌病治疗提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种
嗜水气单胞菌(BNCC186123)和维氏气单胞菌(BNCC138468)均从北京北纳创联生物有限公司购买。
1.1.2 药品
二氢杨梅素(含量98%)购自贵州苗药生物技术有限公司,藤茶粉购自陕西宝禾生物科技有限公司。
1.1.3 培养基
固体培养基:准确称取牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、琼脂粉10 g、氯化钠5 g,溶于1 L蒸馏水中,加热搅拌溶解后调节pH在7.0~7.5之间,121℃灭菌20 min,备用。
液体培养基:准确称取牛肉膏 5 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g,溶于1 L蒸馏水中,加热搅拌溶解后调节pH在7.0~7.5之间,121℃灭菌30 min,备用。
1.1.4 主要仪器
高压蒸汽灭菌锅、摇床、全自动生化培养箱、超净工作台。
1.2 方法
1.2.1 菌悬液的制备
用小砂轮在安瓿管身1/2处划两圈,再用75%酒精擦拭管壁消毒,用手掰断或用镊子敲断安瓿管,吸取约0.4 mL液体培养基溶解菌粉,菌悬液则移入指定的液体培养基内,并按照37℃、150 r/min培养18~24 h。用移液枪取1 mL菌液于EP管中,以10 000 r/min离心1 min,倒掉上清液,加入1 mL无菌水,混匀,再进行10倍稀释,然后用麦氏比浊管进行对比,得出细菌的数量。调整菌液浓度以1×108 cfu/mL作为供试菌液。
1.2.2 药液的制备
根据萧力争等[15]的研究结果,茶叶提取物对细菌的最低抑菌浓度不超过10 mg/mL,二氢杨梅素对细菌的最低抑菌浓度不超过1.76 mg/mL,称取1.00 g藤茶粉加入10 mL无菌水,配置成100 mg/mL药液,再用无菌水以二倍稀释法配成50、25、12.5、6.25 mg/mL药液。称取0.20 g二氢杨梅素,加入10 mL 80%乙醇配置成20 mg/mL药液,用无菌水以二倍稀释法配成 10、5、2.5、1.25 mg/mL药液。
1.2.3 抑菌试验
在超净台上每个平板中加入20 μL菌悬液,用无菌L型涂布器涂布均匀直到看不见明显的水滴为止,每种菌设3个重复,用内径为6 mm的无菌打孔器进行打孔,每个平板打6个孔,在每个孔中加入10 μL 0.7%琼脂液(约60℃)进行封底[16],其中5个孔中依次加入80 μL不同浓度的药液,剩下的一个孔加入80 μL溶剂(藤茶粉用无菌水,二氢杨梅素用80%乙醇[4,15])作空白对照,将加好药液的培养皿放入37℃全自动生化培养箱中培养24 h,最后用游标卡尺测量抑菌圈的大小并记录。判定标准:抑菌圈直径≥20 mm为极敏,15 mm≤抑菌圈直径<20 mm为高敏,10 mm≤抑菌圈直径<15 mm为中敏,抑菌圈直径<10 mm为低敏[17]。
1.2.4 最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的测定
将每种指示菌作为1组,每组取7支无菌试管并进行编号,每支试管均加入2 mL液体培养基,用移液枪向1号试管中加入药液2 mL,混匀后,吸取2 mL到2号管中依次类推,最后从5号试管中吸取2 mL丢弃,6号加入2 mL培养基作阴性对照(试管中均加入50 μL菌液),7号试管中只加2 mL培养基作空白对照,每组设3个重复,以上操作每次均更换枪头。最终配置成表1中的浓度。在摇床中以37℃、150 r/min培养24 h。观察菌液生长状况,菌液澄清时所对应的药液为MIC[18]。选取所有清晰无菌生长的试管[19],取50 μL样液涂布于营养琼脂培养基上,37℃过夜培养 24 h,能杀死99.9% 接种的细菌(平板上不超过5个菌落)对应的最低药物浓度即为MBC[20]。
表1 藤茶成分浓度
Tab.1
| 成分 Component | 浓度/(mg/mL) Concentration | |||
|---|---|---|---|---|
| 藤茶粉Ampelopsis powder 100 | 50 | 25 | 12.5 | 6.25 |
| 二氢杨梅素Dihydromyricetin 20 | 10 | 5 | 2.5 | 1.25 |
2 结果与分析
2.1 藤茶粉对维氏气单胞菌和嗜水气单胞菌的抑菌效果
图1
图1
藤茶粉对供试菌种的抑菌效果
注:0为空白对照,1为100 mg/mL,2为50 mg/mL,3为25 mg/mL,4为12.5 mg/mL,5为6.25 mg/mL。
Fig.1
Antibacterial effect of ampelopsis powder on tested strain
Notes:0 was blank control,1 was 100 mg/mL,2 was 50 mg/mL,3 was 25 mg/mL,4 was 12.5 mg/mL,5 was 6.25 mg/mL.
表2 藤茶粉对维氏气单胞菌和嗜水气单胞菌的抑菌效果
Tab.2
| 供试菌种 Tested strain | 浓度/(mg/mL) Concentration | 抑菌圈直径/mm Inhibition zone diameter | 结果判断 Judge results |
|---|---|---|---|
维氏气单胞菌 Aeromonas veronii | 100 | 20.23±1.62 | 极敏 |
| 50 | 18.64±2.61 | 高敏 | |
| 25 | 16.34±2.97 | 高敏 | |
| 12.5 | 11.83±3.37 | 中敏 | |
| 6.25 | 8.29±0.47 | 低敏 | |
| 空白对照 | - | - | |
| 嗜水气单胞菌 Aeromonas hydrophila | 100 | 20.58±0.63 | 极敏 |
| 50 | 19.18±1.30 | 高敏 | |
| 25 | 17.27±0.58 | 高敏 | |
| 12.5 | 12.58±3.30 | 中敏 | |
| 6.25 | 8.84±1.03 | 低敏 | |
| 空白对照 | - | - |
2.2 二氢杨梅素对维氏气单胞菌和嗜水气单胞菌的抑菌效果
图2
图2
二氢杨梅素对供试菌种的抑菌效果
注:0为空白对照,1为20 mg/mL,2为10 mg/mL,3为5 mg/mL,4为2.5 mg/mL,5为1.25 mg/mL。
Fig.2
Antibacterial effect of dihydromyricetin on tested strain
Notes:0 was blank control,1 was 20 mg/mL,2 was 10 mg/mL,3 was 5 mg/mL,4 was 2.5 mg/mL,5 was 1.25 mg/mL.
表3 二氢杨梅素对维氏气单胞菌和嗜水气单胞菌的抑菌效果
Tab.3
| 供试菌种 Test strains | 浓度/(mg/mL) Concentration | 抑菌圈直径/mm Inhibition zone diameter | 结果判断 Judge results |
|---|---|---|---|
维氏气单胞菌 Aeromonas veronii | 20 | 15.28±1.28 | 高敏 |
| 10 | 13.21±0.43 | 中敏 | |
| 5 | 11.35±0.52 | 中敏 | |
| 2.5 | 11.13±0.74 | 中敏 | |
| 1.25 | 9.51±1.26 | 低敏 | |
| 空白对照 | - | - | |
| 嗜水气单胞菌 Aeromonas hydrophila | 20 | 15.54±0.23 | 高敏 |
| 10 | 14.17±1.60 | 中敏 | |
| 5 | 11.36±0.80 | 中敏 | |
| 2.5 | 10.64±0.24 | 中敏 | |
| 1.25 | 9.34±1.12 | 低敏 | |
| 空白对照 | - | - |
2.3 藤茶粉MIC和MBC的测定
藤茶粉MIC和MBC的测定结果如表4所示,藤茶粉对维氏气单胞菌和嗜水气单胞菌的MIC和MBC均为6.25 mg/mL,表明藤茶粉具有抗菌活性,对维氏气单胞菌和嗜水气单胞菌均有抗菌作用。
表4 藤茶粉MIC和MBC测定
Tab.4
| 供试菌种 Tested strain | 最小抑菌浓度/ (mg/mL) MIC | 最小杀菌浓度/ (mg/mL) MBC |
|---|---|---|
| 维氏气单胞菌Aeromonas veronii | 6.25 | 6.25 |
| 嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila | 6.25 | 6.25 |
2.4 二氢杨梅素MIC和MBC的测定
结果显示,二氢杨梅素对维氏气单胞菌和嗜水气单胞菌的MIC和MBC均为1.25 mg/mL(表5)。结果表明,二氢杨梅素具有抗菌活性,对维氏气单胞菌和嗜水气单胞菌均有抗菌作用。
表5 二氢杨梅素MIC和MBC测定
Tab.5
| 供试菌种 Tested strain | 最小抑菌浓度/ (mg/mL) MIC | 最小杀菌浓度/ (mg/mL) MBC |
|---|---|---|
| 维氏气单胞菌Aeromonas veronii | 1.25 | 1.25 |
| 嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila | 1.25 | 1.25 |
3 讨论
3.1 抑菌试验的影响因素
衮秀群[21]的研究表明,药液浓度的高低与药物色泽的深浅有直接关系。由于本试验中配制的藤茶粉药液颜色较深,可能会导致在判断药液的清澈程度、观察试管中细菌生长情况时结果不太准确,但可做含药培养基来解决药液颜色干扰的问题。
本研究结果显示,藤茶粉和二氢杨梅素对维氏气单胞菌和嗜水气单胞菌均有抑制作用,藤茶粉和二氢杨梅素对以上两种细菌的MIC和MBC分别为6.25、1.25 mg/mL;刘胜贵等[22]研究显示,藤茶不同器官(根、茎、叶)的提取液对粪球杆菌的MIC分别为7.81、0.98、0.98 mg/mL,对大肠杆菌的MIC分别为500.00、25.00、7.81 mg/mL,对阴沟杆菌的最小抑菌浓度分别为31.25、15.68、7.81 mg/mL;萧力争等[4]的研究表明二氢杨梅素对枯草芽孢杆菌和链球菌的MIC高于3.52 mg/mL,说明不同的藤茶成分来源对不同的细菌抑制效果不同,藤茶粉和二氢杨梅素有广谱抑菌的作用。邓新武等[23]研究表明,不同方法提取的藤茶抑菌效果不同;吴海顺等[24]研究提到提取溶剂浓度会影响藤茶活性物质的溶解度,进而影响其活性成分的功效。由于本试验的药品是从公司购买的成品,选材、加工提取的不同可能会导致药品的有效成分和含量不一,可能会影响抑菌效果。
3.2 探究藤茶粉和二氢杨梅素治疗由气单胞菌属引起的鱼病
4 结论与展望
本研究选用藤茶粉和二氢杨梅素分别对维氏气单胞菌和嗜水气单胞菌进行体外试验,结果显示,藤茶粉对维氏气单胞菌和嗜水气单胞菌的MIC和MBC均为6.25 mg/mL;二氢杨梅素对维氏气单胞菌和嗜水气单胞菌的MIC和MBC均为1.25 mg/mL,表明藤茶粉和二氢杨梅素对以上两种细菌均有一定的抑制作用。
中草药具有毒副作用小、污染低[29]、不易产生抗药性的特点,且含有生物碱、苷类、糖类、黄酮、油脂、氨基酸和多种常量及微量元素,这些成分既能补充动物营养,又有抗菌和免疫作用,可以增强机体的免疫和抗病能力[30]。藤茶是一种中草药,除了含有黄酮、多糖、多酚和挥发油外,还含有氨基酸和微量元素等[31]。有研究表明,藤茶中含有17种氨基酸,包括蛋氨酸、谷氨酸等8种人体必须氨基酸[32]。二氢杨梅素可以促进鲤鱼生长,提高形态指标,防止体内脂质的过氧化损伤[33]。藤茶粉和二氢杨梅素既能抑菌,又能促进水产动物的生长,还能提高机体免疫力,因此选用适宜的抗菌药物与中草药联用治疗疾病[34]或者作为饲料添加剂应用到水产上具有广阔的前景。
参考文献
藤茶的研究进展
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本文概述近年来对药食两用野生植物-藤茶的开发利用、特别是其药理作用与生物活性的研究进展。
中草药及复方对嗜水气单胞菌体外抑菌作用研究
[J/OL].
一株大黄鱼致病性溶藻弧菌的分离鉴定与毒力相关基因分析
[J].2018年，宁德蕉城大湾渔排大黄鱼出现体表和鳍条溃疡、出血、鳃缺损等症状。为鉴定该菌株并评估其致病性，本研究从患病大黄鱼鳃部分离得到一株优势菌株，生理生化特征显示，该菌株可在TCBS培养基上生长，菌落颜色为黄色，为革兰阴性短杆菌，具有嗜盐性，生理生化指标与标准株17700一致。结合生理生化指标与16SrDNA 分析，确定该菌为溶藻弧菌，命名为Val180620。攻毒结果显示，Val180620菌株对大黄鱼具有较强的致病力，在水温25 ℃腹腔注射感染时，对规格（20±2）g大黄鱼的LD50为2.38×106 CFU。毒力相关基因分析结果表明，Val180620菌株携带有CollagenaseVA、ToxR、FlaA和TRH等毒力相关基因。此外，本研究未从菌株Val180620中检测出UreR基因，但菌株Val180620仍表现出较强的致病性，说明UreR不是决定溶藻弧菌毒力的主要因子。
凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死病病原分离鉴定及耐药性分析
[J].本研究从疑似患急性肝胰腺坏死病（Acute hepatopancreas necrosis disease, AHPND) 的凡纳滨对坏(Litopenaeus vannamei)肝胰腺组织中分离到一株优势菌株，采用16S rRNA分析，结合生理生化和质谱特征，鉴定该株优势菌为副溶血狐菌（Vibrio parahemolyticus）。毒力基因分析结果显示，菌株携带毒力蛋白PirA&BVP相关毒力基因PirVPA和PirVPB，但不携 带副溶血弧菌主要致病因子耐热直接溶血毒素基因Tdh和相对耐热溶血毒素基因Trh。对健康对虾进行回归感染，72 h全部死亡，临床症状符合典型AHPND症状。药物敏感性分析结 果显示，该菌株对甲砜霉素、氟苯尼考等6种药物敏感，对氨苄西林钠、盐酸土霉素等4种药物耐药，对硫酸新霉素、恩诺沙星等2种药物表现为中介。这可为对虾急性肝胰腺坏死病的流行病学研究和防控技术开发提供基础资料。
山姜素对鱼源耐药性嗜水气单胞菌体外抗菌作用的研究
[J].旨为探究山姜素对耐药性嗜水气单胞菌的体外抑菌效果及其作用机制。通过测定山姜素对嗜水气单胞菌生长、细菌形态、电导率、乳酸脱氢酶（LDH）、蛋白质代谢和DNA的影响,研究山姜素对耐药性嗜水气单胞菌的抑菌机制。山姜素对5株鱼源耐药性嗜水气单胞菌的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）分别为128-256 μg/mL和512-1 024 μg/mL。与对照组相比,2MIC山姜素作用于嗜水气单胞菌CW株8 h、16 h后,菌体皱缩,细胞壁和细胞膜破损,细胞质丢失,内部空化;作用2 h后,菌悬液电导率、乳酸脱氢酶含量、DNA外渗量分别增长了3.97%、26.09%和10.50 μg/mL;作用2、4和8 h后,菌悬液核酸荧光强度和密度呈现随时间降低的趋势。山姜素对嗜水气单胞菌的体外抑菌机制为损伤菌体的细胞壁、增加细胞膜的通透性来抑制其生长繁殖。
3种中草药对罗非鱼无乳链球菌抑菌效果的Meta分析
[J].通过在知网、维普、万方、读秀等数据库搜索有关中药对无乳链球菌抑菌效果的相关文章，采集数据，使用RenMan5.3进行Meta分析统计分析，评价大黄(Rheum)、五倍子(Rhus chinensis)、黄连(Coptis chinensis)3种中草药对无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）的体外抑菌效果，为中药防治无乳链球菌的筛选和复方的配置提供科学的参考。研究共纳入相关文献2篇，经过Meta统计分析，3种中药的体外抑菌效果为：黄连>大黄、黄连>五倍子、五倍子>大黄，均具有统计学意义，敏感分析结果稳健。研究结果表明3种中草药对无乳链球菌的体外抑菌效果大小为：黄连>五倍子>大黄，这一结果需要在养殖过程中进一步验证。
表1
图1
