石油烃污染是当今世界各国普遍关注的污染问题之一,随着我国石油化工产业的发展,部分海区、河流和底质受到石油类污染[1-2],水产品的产地环境也面临着石油烃污染的威胁,石油烃污染不仅影响水产品的食用价值,而且其致癌性、致畸性和难降解性也令消费者“谈油色变”,严重影响水产品的经济价值[3⇓-5]。中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)是我国特有的大型淡水蟹类,因具有特殊的风味和丰富的营养价值及药用价值而广受国人青睐。近年来,我国的中华绒螯蟹产量逐年增长,目前年产量已达到80×104 t左右[6],根据农业农村部公布的《2021中国渔业统计年鉴》的数据计算,中华绒螯蟹产量占我国淡水水产品总产量的2.4%左右[7]。中华绒螯蟹已成为我国一种重要的淡水水生生物资源。
目前,国内外学者对石油烃在生物体内的富集机理及组织器官间的分布等进行了许多研究[8-9]。石油烃对我国水生生物的污染动力学研究主要集中在其对藻类、贝类、鱼类等物种早期发育的影响[10⇓-12],而石油烃对甲壳类的污染动力学研究相对较少,甲壳类对石油烃的富集代谢规律及石油烃在养殖环境和甲壳类体内的含量关系等方面仍缺少系统的研究。因此,本研究选用甲壳类中具有代表性的中华绒螯蟹为对象,通过生态实验手段和化学分析相结合的方法,在实验室模拟研究了中华绒螯蟹对石油烃的富集代谢规律,量化石油烃在中华绒螯蟹体内的生物富集系数(Bioconcentration factor,BCF),根据蟹体内石油烃的限量判定其安全阈值,旨在为制定中华绒螯蟹的健康化养殖规范和卫生标准提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验用水
辽宁省盘锦市大洼县稻田蟹养殖水经脱油过滤、48 h沉淀、气石曝气后,备用。溶解氧浓度大于8.0 mg/L,水温20~23℃。
1.1.2 实验生物
实验受试生物中华绒螯蟹均取自盘锦稻田蟹养殖区,体质量50 g左右,雌、雄随机,实验前暂养7 d,选择大小适宜、健康无病、活动正常的中华绒螯蟹,备用。
1.1.3 石油烃标准品
石油烃标准品(1 000 mg/L),编号GBW(E)080913,购于国家海洋环境监测中心。
1.1.4 石油烃母液(WSF)的配制
1 L烧杯中加入0#柴油和实验用水,体积比约为1∶1,磁力搅拌器搅拌24 h,放置分层,虹吸下层溶液作为实验用母液。稳定后测定母液中石油烃浓度为2.25 mg/L。
1.2 方法
1.2.1 水中石油烃的测定
采用HJ 637—2012《水质 石油类和动植物油类的测定 红外分光光度计法》[13]测定水中石油烃浓度。
1.2.2 中华绒螯蟹中石油烃的测定
参照GB 17378.6—2007《海洋监测规范 第6部分 生物体分析》,采用荧光分光光度法[14]测定中华绒螯蟹中的石油烃含量。
1.2.3 生物富集实验
设3个实验组、1个空白对照组,每组设2个平行,每个容器40只中华绒螯蟹。以体积约30 L的水族箱作为实验容器,加入10 L实验用水。内置一个循环泵充氧,水中溶解氧浓度不低于8.0 mg/L。3个实验组养殖水体中石油烃浓度分别为2.25、1.81和1.43 mg/L,稳定24 h后放入中华绒螯蟹进行生物富集,分别于富集的0.5、1、2、4、6、8、10、12和14 d采集中华绒螯蟹样品,各实验组随机选取2只中华绒螯蟹,剪碎去壳后,取肌肉和内脏团混合并用匀浆器匀浆,置于-18℃保存,待测石油烃含量。
中华绒螯蟹对石油烃的富集能力用生物富集系数(BCF)表示。BCF=Cfs/Cws,式中Cfs为平衡时生物体内石油烃含量;Cws为平衡时养殖水体中石油烃浓度。
1.2.4 感官评定实验
实验组别和实验条件同1.2.3,每个容器20只中华绒螯蟹,3个实验组浓度分别为2.25、1.81、1.43 mg/L,稳定24 h后放入中华绒螯蟹进行生物富集,分别于富集的3、6、12、24、30、40和48 h从各实验组中随机选取2只中华绒螯蟹,剪碎混合后用匀浆器匀浆,待测石油烃含量。同时把取得的中华绒螯蟹样品按顺序编号。
表1 感官评定判断标准
Tab.1
| 评价指标 Evaluation index | 评价等级 Evaluation rating | ||
|---|---|---|---|
| 感官 Sensory | 没有异味 | 有少量异味 | 有异味 |
| 嗅觉 Smell | 具有中华绒螯蟹固有香味(A) | 有轻微石油烃异味(B) | 有石油烃异味(C) |
| 味觉 Gustation | 具有中华绒螯蟹固有鲜味(a) | 有轻微石油烃异味(b) | 有石油烃异味(c) |
1.2.5 石油烃代谢实验
将富集实验的3个实验组养殖水体换成空白养殖水体后继续养殖,其他实验条件与1.2.3生物富集实验相同,并分别于换水后的0.5、1、2、4、6、8、10、12和14 d从各实验组中随机选取2只中华绒螯蟹,剪碎混合后用匀浆器匀浆,待测石油烃含量。
1.2.6 安全阈值实验
实验组别和实验条件同1.2.3,实验组水体石油烃浓度为国家限量标准0.05 mg/L[16],稳定24 h后放入中华绒螯蟹进行生物富集,分别于富集后的7、14和21 d从各实验组中随机选取2只中华绒螯蟹,取性腺、肝胰腺和肌肉等可食部分,剪碎混合后用匀浆器匀浆,测定石油烃含量。
1.2.7 数据统计
石油烃含量数据采用平均值±标准差(Mean±SD)表示;数据统计分析采用SPSS 19.0软件,进行单因素方差分析(ANOVA)及相关性分析,显著性差异水平P<0.05为差异显著,P<0.01为差异极显著。
2 结果与分析
2.1 水中石油烃含量的测定
测定浓度为1、2、5、8、10 μg/mL的石油类标准系列溶液,得出水中石油烃的标准曲线回归方程:y=0.066 291x+0.009 961 3(R2=0.999 31),线性关系良好。
2.2 中华绒螯蟹中石油烃含量的测定
测定浓度为0、1、3、5、7、9 μg/mL的石油类标准系列溶液,得出中华绒螯蟹中石油烃的标准曲线回归方程:y=-1.048 6x+0.014 551(R2=0.999 42),线性关系良好。
2.3 富集规律
各实验组的富集量及差异性分析见表2,可以看出3个不同浓度组中中华绒螯蟹均表现出明显的蓄积效应,随着浓度增加和实验时间的推进,蟹体内石油烃含量明显增大。总体上,各组间及同一组不同富集天数的蓄积量差异极显著。
表2 生物富集实验中华绒螯蟹体内石油烃含量
Tab.2
| 富集天数/d Enrichment days | 石油烃含量/(mg/kg) Petroleum hydrocarbons concentration | ||
|---|---|---|---|
| 实验组1 Group 1 | 实验组2 Group 2 | 实验组3 Group 3 | |
| 0.5 | 15.07±0.61Aa | 9.95±1.06Ba | 8.83±0.90Ba |
| 1 | 44.62±3.84Ab | 11.24±1.93Ba | 9.82±1.08Ba |
| 2 | 63.81±5.27Ac | 12.23±2.05Ba | 11.54±2.02Ba |
| 4 | 90.51±4.70Ad | 30.82±4.89Bb | 26.54±3.98Bb |
| 6 | 115.25±5.85Ae | 57.54±5.99Bc | 33.76±4.38Cc |
| 8 | 128.21±5.88Af | 68.54±4.50Bd | 44.32±5.13Cd |
| 10 | 132.54±5.97Af | 69.24±4.34Bd | 45.10±4.13Cd |
| 12 | 127.55±4.93Af | 71.15±3.01Bd | 45.70±3.86Cd |
| 14 | 130.72±7.56Af | 76.17±5.64Be | 47.02±3.65Cd |
注:标注的小写字母表示同一组不同富集天数间的差异显著性,小写字母不同表示差异极显著(P<0.01);标注的大写字母表示同一富集实验不同实验组间的差异显著性,大写字母不同表示差异极显著(P<0.01)。
Notes:Marked with lowercase letters indicated significant difference between different enrichment days in the same group,and different lowercase letters indicated extremely significant difference(P<0.01);marked with capital letters indicated significant difference between different experimental groups in the same enrichment experiment,and different capital letters indicated extremely significant difference(P< 0.01).
富集实验初期,各实验组对石油烃的富集速度较快,呈现出快速增长的趋势,随着实验的推进,各实验组的石油烃富集逐渐趋于饱和且呈现缓慢增长的趋势,最终各实验组蟹体对石油烃的富集达到饱和,富集浓度不再明显增大。各实验组石油烃在蟹体内和养殖水体之间达到稳态平衡的时间均为8 d左右,经计算,各实验组石油烃平均富集速率由大到小分别为22.0 mg/(kg·d)(实验组1)、9.05 mg/(kg·d)(实验组2)、6.97 mg/(kg·d)(实验组3)。蟹体对石油烃的富集量与养殖水中石油烃浓度呈正相关关系,即养殖水体中石油烃浓度越大,蟹体富集的石油烃含量越高,进一步利用SPSS 19.0统计软件,对表2各实验组在不同富集时间蟹体内石油烃含量的结果进行相关性分析,得出中华绒螯蟹体内石油烃富集量和养殖水体中石油烃浓度在0.01水平上呈现显著相关,相关系数为0.654。
表3 中华绒螯蟹生物富集系数计算结果
Tab.3
| 富集时间/d Enrichment days | 实验组1 Group 1 | 实验组2 Group 2 | 实验组3 Group 3 | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Cfs | Cws | BCF | Cfs | Cws | BCF | Cfs | Cws | BCF | |
| 8 | 128.21 | 2.16 | 59.4 | 68.54 | 1.81 | 37.9 | 44.32 | 1.43 | 31.0 |
| 10 | 132.54 | 2.25 | 58.9 | 69.24 | 1.86 | 37.2 | 45.10 | 1.44 | 31.3 |
| 12 | 127.55 | 2.18 | 58.5 | 71.15 | 1.82 | 39.1 | 45.70 | 1.43 | 32.0 |
| 14 | 130.72 | 2.27 | 57.6 | 76.17 | 1.81 | 42.1 | 47.02 | 1.45 | 32.4 |
| 均值Average | 129.76 | 2.22 | 58.6 | 71.28 | 1.82 | 39.1 | 45.54 | 1.44 | 31.7 |
图1
2.4 感官评定
人类的嗅觉、味觉对石油烃异味比较敏感,因此可以用感官评定法对经过石油烃富集后的中华绒螯蟹的食用性作出感官判断。感官实验结果见表4,实验组3的各时间段中华绒螯蟹煮熟后,气味和口味正常,感官评定人员未发现有石油烃异味存在。实验组2的中华绒螯蟹煮熟后,基本无异样,但是当富集时间达到40 h时,中华绒螯蟹体中石油烃含量达到12.09 mg/kg,蟹体出现轻微的石油烃异味,已不适宜食用。实验组1的中华绒螯蟹在石油烃富集6 h后便开始出现少量的石油烃异味;当富集时间累积达到12 h时,中华绒螯蟹体中石油烃含量为15.07 mg/kg,其可产生口味异味;当富集时间累积达到24 h时,中华绒螯蟹体中石油烃含量达到44.62 mg/kg,已能够被明显分辨出石油烃异味,已严重影响了中华绒螯蟹的品质,完全不适宜食用。因此根据本实验结果,确定中华绒螯蟹的石油烃异味阈值为12.09~15.07 mg/kg。
表4 石油烃感官评定结果
Tab.4
| 富集时间/h Enrichment time | 实验组1 Group 1 | 实验组2 Group 2 | 实验组3 Group 3 | |||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 感官结果 Sensory results | 石油烃含量/ (mg/kg) Petroleum hydrocarbons concentration | 感官结果 Sensory results | 石油烃含量/ (mg/kg) Petroleum hydrocarbons concentration | 感官结果 Sensory results | 石油烃含量/ (mg/kg) Petroleum hydrocarbons concentration | |
| 3 | A-a | 10.23±0.63 | A-a | 5.51±0.40 | A-a | 4.15±0.41 |
| 6 | B-b | 12.51±1.01 | A-a | 7.43±0.65 | A-a | 6.28±0.52 |
| 12 | C-b | 15.07±0.99 | A-a | 9.95±0.58 | A-a | 8.83±1.04 |
| 24 | C-c | 44.62±4.19 | A-a | 11.24±0.66 | A-a | 9.82±1.15 |
| 30 | C-c | 50.24±3.88 | A-a | 11.53±0.80 | A-a | 10.23±0.97 |
| 40 | C-c | 56.66±3.84 | B-a | 12.09±0.58 | A-a | 11.23±0.64 |
| 48 | C-c | 63.81±2.11 | B-b | 12.23±1.28 | A-a | 11.54±0.75 |
注:感官结果中英文字母含义见
Note:The meaning of English letters in sensory results as shown in
2.5 代谢规律
将3个实验组的中华绒螯蟹从含有石油烃的养殖水体中更换至空白养殖水体中,进行石油烃污染物的代谢规律研究,不同代谢时间段对中华绒螯蟹体中石油烃残留量的检测结果见表5。由于代谢实验中每天更换实验用水,因此石油烃趋向于由生物体向养殖水体中排放的趋势,但是由于石油烃的难代谢、难降解等特性,使其代谢排出的速度趋于逐渐放缓。各实验组的中华绒螯蟹随着养殖环境中石油烃的去除,其体内的石油烃含量均表现出降低趋势,高浓度组的中华绒螯蟹排出石油烃的速度较快,中、低浓度组的中华绒螯蟹排出石油烃速度较慢,整体上,实验组间和实验组内的不同时间段蟹体内石油烃含量的差异极显著。经过14 d代谢实验后,各实验组蟹体内石油烃的含量均大幅降低,实验组1蟹体内石油烃的平均含量由131.24 mg/kg降低至21.27 mg/kg,实验组2和实验组3蟹体内石油烃含量均降至初始含量的1/5左右,且低浓度组(实验组3)蟹体内石油烃含量最终降至国家标准要求的限量15 mg/kg以下,但中、高浓度组(实验组2和实验组1)实验蟹体内的石油烃含量仍未降至限量以下。
表5 代谢实验中华绒螯蟹体内石油烃含量
Tab.5
| 代谢天数/d Metabolic days | 石油烃含量/(mg/kg) Petroleum hydrocarbons concentration | ||
|---|---|---|---|
| 实验组1 Group 1 | 实验组2 Group 2 | 实验组3 Group 3 | |
| 0.5 | 131.24±5.98Aa | 75.81±4.59Ba | 45.57±3.47Ca |
| 1 | 117.26±7.27Ab | 65.45±3.20Bb | 40.02±2.47Cb |
| 2 | 106.84±6.10Ac | 56.21±2.80Bc | 33.24±2.10Cc |
| 4 | 95.12±3.64Ad | 50.64±2.22Bd | 28.82±1.73Cd |
| 6 | 73.26±3.97Ae | 41.89±3.03Be | 26.61±2.67Cd |
| 8 | 53.06±2.37Af | 34.44±2.91Bf | 20.33±3.25Ce |
| 10 | 38.18±3.10Ag | 27.16±2.06Bg | 16.42±1.11Cf |
| 12 | 30.46±1.97Ah | 21.05±2.63Bh | 12.29±2.08Cg |
| 14 | 21.27±1.83Ai | 16.92±2.21Bi | 10.45±1.00Cg |
2.6 安全阈值
在中华绒螯蟹养殖水体中添加浓度为国家限量标准0.05 mg/L的石油烃并用其养殖中华绒螯蟹21 d,结果表明,蟹体内石油烃含量在7 d左右达到含量最大值2.21 mg/kg,14 d和21 d均降低至检出限(1.0 mg/kg)以下,均低于农业行业标准对中华绒螯蟹体中石油烃的限量要求。因此,养殖水体中石油烃的安全阈值为0.05 mg/L。
3 讨论
3.1 中华绒螯蟹体中石油烃异味阈值
石油烃异味实验结果显示,当蟹体内石油烃含量达12.09 mg/kg时,中华绒螯蟹可产生气味异味;当石油烃含量达15.07 mg/kg时,中华绒螯蟹可产生口味异味,因此本研究确定12.09~15.07 mg/kg为中华绒螯蟹出现石油烃异味的阈值,这小于鱼类50~100 mg/kg和双壳贝类25~30 mg/kg的石油烃异味阈值[8]。农业农村部标准NY 5073—2006《无公害食品 水产品中有毒有害物质限量》中规定水产品中石油烃限量为15 mg/kg,而当中华绒螯蟹体内石油烃含量为12.09 mg/kg时,即可通过气味辨识出石油烃的存在,但其异味阈值区间12.09~15.07 mg/kg也基本在限量之下,因此即使在安全限量以下的中华绒螯蟹产品也有可能产生石油烃异味,从而影响中华绒螯蟹的食用品质。
3.2 生物富集代谢规律
BCF是评估水生生物对污染物富集水平的一个重要参数,本实验得到中华绒螯蟹对石油烃的BCF为31.7~58.6,平均值为43.1,而姜朝军等[10]研究贝类对石油烃的BCF为545;林建清等[20]研究鲈鱼对石油烃中毒性最强的多环芳烃的BCF大于500。与之相比,本研究中华绒螯蟹对石油烃的蓄积水平低于贝类和鱼类,但蔡玉婷等[21]对福建沿海生物体内石油烃含量的监测结果是甲壳类中石油烃含量介于鱼类和贝类之间,出现结果偏差的原因可能是石油烃的组成和特性、水温、pH、受试生物大小、性别、品质、生长周期、养殖水体中石油烃的浓度等诸多因素都会对BCF值产生影响,因此不同研究实验所测得的BCF值会存在较大的差异[17,22]。
中华绒螯蟹体内石油烃的排出规律同样呈现出前期快、后期慢并逐渐趋于平衡的规律,通过把受石油烃污染的中华绒螯蟹放置在洁净环境中养殖一段时间后,结果可明显降低中华绒螯蟹体内石油烃的残留量,但即使经过与富集时间相同的天数后,中华绒螯蟹体内的石油烃含量仍未恢复到富集初期水平,蟹体内的石油烃含量越高,其代谢周期越长,由此可见,石油烃具有难代谢性。石油烃成分复杂,其中多环芳烃(PAHs)是造成其难代谢的主要成分,它不仅降解率低,还会导致生物受到毒害。多环芳烃的成分也十分复杂,其中某些组分的癌症潜伏期长达50年[10]。由于石油烃的难代谢性和强毒性,围绕石油烃的相关研究越发受到各地渔业部门的重视[23⇓-25]。
3.3 养殖水体中石油烃安全阈值的探讨
参考文献
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Petroleum hydrocarbon in the marine bivalve Venus verrucoas:accumulation and cellular responses
[J].
养殖水体中多环芳烃污染对水产品安全的影响
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本文采取现场研究和实验室研究相结合的方式,研究了16种典型的多环芳烃在海水养殖鱼类鲈鱼肝脏的蓄积作用,以及在清洁海水暂养下的去除作用。结果表明:(1)鲈鱼肝脏对水体中16种多环芳烃的富集系数大于500,并随着多环芳烃分子量的增大而增大,对于海洋食品的安全构成一定的威胁。(2)在鲈鱼肝脏中,高分子量多环芳烃比低分子量多环芳烃易于清除。(3)采用一级指数衰减方程描述了多环芳烃在鲈鱼肝脏的代谢过程,对于高分子量的多环芳烃的半减期为1.7～2.5d,而低分子量多环芳烃的半减期为3.4～24d。通过清洁海水暂养,能有效地减少多环芳烃污染对水产品的食品安全风险。
Bioaccumutlation of trace metals in the copepod Calanoides acutus from the weddell sea(Antartica):Comparison of two-compartment and hyperbolic toxicokinetic models
[J].
石油烃分散液对华贵栉孔扇贝(Chlamys nobilis)的急性毒性影响
[J].本文通过石油烃分散液对华贵栉孔扇贝的急性毒性试验，经SPSS的probit分析结果表明，石油烃分散液对华贵栉孔扇贝的24h LC50、48h LC50、72h LC50和96h LC50浓度依次是233.08、147.30、81.67和75.16 mg/L ，安全浓度Sc是17.65 mg/L。通过生物富集试验结果显示，华贵栉孔扇贝在120 h 内对石油烃的富集效果与浓度和时间成正比。石油烃分散液胁迫下对华贵栉孔扇贝血清中POD、SOD 酶活的影响呈现出低浓度促进、高浓度抑制的特征，并对其肝、總组织AKP酶活性具有促进作用。
海洋主要污染物对贝类及其环境的影响
[J].为给海水贝类健康养殖提供依据，本文总结了近年国内外的报道，从氮、磷、重金属、石油类、有机氯农药等海洋污染物对贝类及其环境影响及进行了归纳综述，发现由于特殊的取食方式，贝类体内的污染物含量较其它生物要高，此外，同种污染物在不同种类贝类体内的积累也存在显著差异。因此，贝类养殖区的选择要比其他养殖区的选择更加谨慎，另外，也可以针对不同养殖海域的具体情况因地制宜的选择不同的养殖种类。
表1
图1
