磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PS)又称丝氨酸磷脂、二酰甘油酰磷酸丝氨酸,存在于动物、高等植物及微生物的生物膜中。PS能够调节脑内情绪神经传输递质的激素水平,同时可以抑制血清中促肾上腺皮质激素和可的松等的水平,对抑郁症病人的情绪紊乱、行为异常、焦虑及易怒等症状具有明显的改善效果^[1-2],以及对因为脑营养不良、脑部损伤或遗传性神经递质数量下降所造成的小儿多动症也有着优越的改善效果^[3⇓-5]。通过工艺研究可制备磷脂含量较高的南极磷虾油^[6],且磷脂主要为磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholine,PC)和磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanolamine,PE)^[7],PC在总磷脂中的占比最高可达99.80%,而其中ω-3多不饱和脂肪酸(EPA、DHA)主要以磷脂形式存在即EPA/DHA型磷脂^[8-9]。众所周知,EPA、DHA作为特定的免疫营养素,具有抗氧化、抗炎、降低血糖及增加机体对胰岛素的敏感性等作用。而且DHA 与PS在辅助改善记忆力和增强免疫能力功能方面存在相互配伍^[10]。

目前商品化的PS主要从大豆中提取,常用的分离方法有吸附分离法、低级醇分离法、CO₂超临界萃取法及膜分离法等。近年来,通过酶改性法制备得到的PS产品越来越多,磷脂酶D能催化甘油C-3位头部末端的磷酸酯键,并在一定条件下催化磷脂酰残基与丝氨酸结合生成PS的单一磷脂产品。通过酶法改性获得的PS具有反应条件温和、速度快、副产物少、酶制剂作用部位准确等特点。2010年,中国将PS列入新资源食品名单,其原料就是大豆卵磷脂和L-丝氨酸,采用磷脂酶转化反应后,纯化浓缩,再经过二次纯化,干燥后包装制得^[11]。本文以南极磷虾油为原料,利用其中富含的EPA、DHA型磷脂,在磷脂酶D的作用下与L-丝氨酸发生转酯反应,制得富含ω-3多不饱和脂肪酸的PS,即EPA/DHA型PS,并通过单因素和正交试验得到最佳制备工艺条件,可进一步拓展南极磷虾油的深加工利用技术,提高其附加值,为营养健康食品高新技术产业作贡献。

磷脂酶D(上海源叶生物科技有限公司);南极磷虾油(PC含量为60%,辽渔集团有限公司);PS标准品(99%以上,Sigma-Aldrich);PC标准品(98%以上,Sigma-Aldrich);甲醇(色谱纯,国药集团化学试剂有限公司);异丙醇(色谱纯,异丙醇);正己烷(色谱纯,国药集团化学试剂有限公司);L-丝氨酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);CaCl₂(国药集团化学试剂有限公司)、冰醋酸(国药集团化学试剂有限公司)、无水乙酸钠(西陇科学股份有限公司)、乙酸乙酯(国药集团化学试剂有限公司)、丙酮(国药集团化学试剂有限公司)、乙醚(国药集团化学试剂有限公司)等均为分析纯。

全温振荡培养箱、旋转蒸发仪、Agilent 1260高效液相色谱仪、pH计、Agilent 8860气相色谱仪等。

一定量的南极磷虾油溶解于有机溶剂并将其作为有机相,将酶、丝氨酸溶解于缓冲溶液,并在缓冲溶液中加入一定量的CaCl₂,以此作为水相,两相分别预热后混合,放入振荡培养箱,于一定温度下振荡反应一定时间后,加入1 mol/L盐酸将酶灭活;将反应混合物静置,分离两相,取有机相,加入2.5倍体积的氯仿,混匀后,静置分层,取氯仿层进行减压蒸馏,除去氯仿,得到富含ω-3多不饱和脂肪酸的PS产物。

采用Agilent 1260 高效液相色谱仪测定PS和PC。色谱条件:色谱柱为ZORBAX RX -SIL Columns(4.6 mm×250 mm);以甲醇-水-冰醋酸(体积比79∶14∶0.23)为流动相A,以异丙醇-正己烷-流动相A(体积比45∶20∶27)为流动相B,按表1进行梯度洗脱;柱温为37°C,用蒸发光散射检测器检测(条件:漂移管温度60°C,载气流量1.8 mL/min),洗脱程序如表1。

标准曲线的绘制:将PS标准品溶解于氯仿/乙腈(体积比为7∶2),配制成浓度分别为0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL的标准溶液,用0.22 μm滤膜过滤后,按照上述方法进行HPLC分析,以标准溶液浓度(mg/mL)为横坐标,以峰面积为纵坐标,绘制标准工作曲线。

待测样品中PS的定量分析:将待测样品处理后,按照同样的分析条件进行HPLC分析,从色谱图中求得峰面积,根据PS标准工作曲线计算进样浓度,从而计算待测样品中PS的总质量。

式中,0.6表示南极磷虾油中PC含量以60%计。

参照GB/T 38095—2019《DHA、EPA含量测定——气相色谱法》。

按照PS的制备方法,设置3个重复水平的试验,以PS得率为考察指标,以南极磷虾油浓度10 mg/mL、丝氨酸与南极磷虾油质量比6∶1、PLD添加量为55 U、反应温度40℃为基础,分别考察了有机相种类(正己烷、乙酸乙酯、乙醚)、反应温度(35、40、45、50、55℃)、水相pH值(3.5、4.0、4.5、5.0、5.5)、有机相和水相体积比(0.25∶1、0.5∶1、1∶1、2∶1、5∶1、10∶1)、丝氨酸与南极磷虾油质量比(2∶1、4∶1、8∶1、16∶1、24∶1、32∶1),以及反应时间(1、2、4、6、8、10、12 h)等因素对 PS 得率的影响。

在1.3.4单因素试验的基础上,设计正交试验L₉(3⁴),并进行3个重复水平的试验,根据试验结果得出PS制备的最佳工艺条件。

本研究采用有机相与水相两相体系,以极性为指标,选取具有代表性的有机溶剂乙酸乙酯、正己烷、乙醚,与醋酸缓冲液混合形成两相反应体系,表3为使用不同有机溶剂时PS的得率。由表3可知,当使用乙酸乙酯时,PS的得率最高;当使用正己烷时,两相体系几乎无反应;当使用乙醚时,PS得率较乙酸乙酯次之。综合PS得率、有机溶剂沸点及毒性,优选乙酸乙酯作为本研究的有机溶剂。

在一定的温度范围内,酶活随反应温度的递增一般呈现先增加后减小的变化,酶活力最高点为其最适反应温度。由图1可以看出,在35~55℃ 的温度范围内,PS的最终得率相差不大,但观察各温度下PS得率随时间变化的曲线可以看出,在 40℃下PS前4 h合成的速度最快,但与45℃反应温度下到达反应平衡状态的时间差别不大。在考虑能耗的情况下,在本试验研究条件中磷脂酶D催化合成 PS 的最适反应温度为40℃左右。

水相pH值对PS得率的影响,主要是通过影响酶活性部位基团离子化程度和三维结构的共价键发挥作用。在反应体系中,酶具有催化底物磷脂进行两种酶促反应的活性:一种是磷脂的水解,产生磷脂酸(Phosphatidic acid,PA);另一种是磷脂酰基转移反应,生成PS。不同pH值对PS得率的影响如图2所示,当pH在3.5~5.5之间时,PS得率呈现先增大后减小的趋势;当 pH为4.5时,PS 的得率达到最大,说明此时酶的转酯活性达到最大。

两相体积比对PS得率的影响如图3所示。两相反应体系中,PS得率随着有机相与水相体积比的增大呈现先增加后减少趋势;当两相体积比小于1∶1时,随着有机相体积比例的增加,酶与磷脂接触几率增大,PS得率增加;当两相体积比达到1∶1时,PS得率达到最大;随着有机相比例继续增大,PS得率开始下降,这可能是由过高的有机相比例影响磷脂酶的活性导致的。

丝氨酸与南极磷虾油质量比对PS得率的影响如图4所示。由图4可知,在丝氨酸与南极磷虾油质量比小于16∶1时,PS得率随着丝氨酸含量的增加而增大,这是因为此时作为底物的丝氨酸的含量的增加对转酯反应的发生具有促进作用;当两者质量比达到16∶1时,PS得率达到最大值,且再提高丝氨酸比例也不再变化,说明此时南极磷虾油中磷脂与酶形成的复合物已经全部被丝氨酸饱和。因此,丝氨酸与南极磷虾油质量比选择16∶1为宜。

反应时间对PS得率的影响如图5所示。随着反应的进行,PS得率迅速增加,随后趋于平缓;当反应进行8 h后,PS得率基本不再变化,说明此时底物转酯反应基本停止。因此试验反应时间选择8 h为宜。

由单因素结果可知,水相pH值、反应温度、有机相与水相的体积比、反应时间对PS得率有较大的影响,因此选择这4个因素设计正交试验,结果如表4所示。

由表4中极差R值可知,各因素对PS得率的影响大小为水相pH值>反应时间>有机相与水相的体积比>反应温度,但方差分析显示,4个因素对制备PS得率的影响均不显著(表5)。本试验结果以PS得率为指标,数值越大越理想,比较表4中4个因素的K1、K2、K3大小,K值最大对应的水平即为最佳水平,因此最佳因素水平组合为A₂B₂C₂D₂,即pH 4.5、反应温度40℃、有机相与水相的体积比1∶1、反应时间8 h。因此,制备PS的最佳工艺条件为水相pH 4.5、有机相水相体积比1∶1、反应温度40℃、加酶量55 U、丝氨酸与南极磷虾油质量比16∶1、反应时间8 h。在此条件下进行3次重复试验,PS得率均值为85.62%(标准偏差S=0.16),产物中EPA含量为24.33%(标准偏差S=0.13),DHA含量为19.95%(标准偏差S=0.12)。

PS作为一种新资源食品,其制备工艺的研究引起较多相关人员的重视,且大多是以大豆磷脂和L-丝氨酸为底物,开展两相体系中酶法制备及纯化工艺的研究^[12⇓-14],如朱世斌^[15]以蛋黄卵磷脂为底物开展酶法制备研究、王焕^[16]以椰子油替代两相反应体系中的有机溶剂开展相关研究;总体来说,PS的制备过程中两相反应体系中有机溶剂种类、pH值、反应时间、反应温度、有机相与水相的体积比、物料质量比等因素对得率均有较大的影响。也有研究人员尝试其他制备工艺,如秦鑫鑫等^[17]等以超临界CO₂为非水反应介质,利用磷脂酶A₁和磷脂酶D催化制备富含DHA的南极磷虾PS,但此研究有两步催化反应,工艺较为复杂,且需要超临界设备才能实现;杜阳吉^[18]则是开展单一水相法催化合成PS的工艺研究,在单一水相中,磷脂酶有很高的水解活性而转酯活性较低,导致最终反应体系中PS的含量仅为15.78%。

本研究中,在有机溶剂种类选择方面,由表3数据可以看出:不同极性有机溶剂作用下PS的得率有所不同,这可能是由于有机溶剂极性影响两相中底物与产物的分配与扩散,从而使反应的平衡常数和速率常数发生变化;其次,不同极性的有机溶剂与酶接触后,对维持酶蛋白活性构型的氢键、疏水键的影响不同,从而导致PS得率有所不同。一方面,乙酸乙酯、乙醚、正己烷三种有机溶剂的极性依次减小,溶剂极性越小,疏水性越强,虽然南极磷虾油磷脂在正己烷中有较大的溶解度,但正己烷强大的疏水性使其很难进入磷脂酶D的必需水层进行反应。另一方面,溶剂极性越强,越容易夺取酶分子的结合水,对酶活力的影响越大,因此乙酸乙酯对酶活力的影响大于乙醚和正己烷。在这两方面影响的共同作用下,对比表3数据可知,以正己烷为有机溶剂的两相反应体系的PS得率最低。

磷脂酶D的最适温度和pH值受其来源影响较大,大多数最适催化温度为25~45℃;微生物来源的磷脂酶D最适 pH 在4~8之间,植物来源的在5~6之间。本试验中磷脂酶D的最适温度为40℃、pH为4.5,在此条件下两相体系中转酯反应和水解反应同时进行,水解反应副产物 PA会影响目标产物 PS 的生成,此时两相体积比、底物质量比显得尤为重要。两相体积比主要是对水相中的酶与有机相中底物的接触概率产生影响,有机相与水相体积比的增加提高了PS得率,当体积比继续增大时,虽然底物和磷脂酶 D 的接触概率提高,但酶更容易与有机溶剂接触而使活性降低,因此 PS 得率逐渐下降。底物质量比则是通过影响反应的化学平衡及与酶的配比,从而影响反应结果。当丝氨酸与酶同处于水相时,作为亲核试剂的丝氨酸首先进入酶活性中心,丝氨酸比例的增加形成了更多的丝氨酸-酶复合物,从而提高了PS得率,当丝氨酸达到一定量后,酶活性中心全部被丝氨酸饱和,PS得率达到最大值。

本研究通过单因素和正交试验,获得富含ω-3多不饱和脂肪酸的PS最佳制备工艺条件:水相pH 4.5、有机相和水相体积比1∶1、反应温度40℃、加酶量55 U、L-丝氨酸与南极磷虾油质量比16∶1、反应时间8 h,在此条件下,PS得率为85.62%,其中EPA含量为24.33%,DHA含量为19.95%。