金鱼(Carassius auratus)隶属于鲤形目(Cypriniformes)、鲤科(Cyprinidae)、鲫属(Carassius),是中国传统的观赏鱼养殖种类,在中国除西藏外的所有省市都有养殖生产,年产值近5亿元[1],同时也是世界流行的观赏鱼品种之一。在金鱼养殖过程中,寄生虫病是发病率较高的一类病害,感染金鱼的寄生虫有黏孢子虫类[如碘泡虫(Myxobolus spp.)、单极虫(Thelohanellus spp.)等]、斜管虫(Chilodonella)、车轮虫(Trichodinella、Tripartiella、Trichodina)、小瓜虫(Ichthyophthirius)、指环虫(Dactylogyrus)、三代虫(Gyrodactylus)、双穴吸虫(Diplostomulum sp.)、锚头鳋(Lernaea)、鲺(Argulus)等[2] 。
碘泡虫是黏孢子虫中最大的类群,全世界已报道的有850余种,中国记录的有320多种,其中寄生于鲫(C.arassius)的碘泡虫最多,有50余种[3]。碘泡虫可寄生于鱼类和两栖类的各类组织中,有些种具有宿主或组织特异性,在寄主组织大量寄生时可引起严重的疾病。以往对碘泡虫的研究主要围绕其在经济鱼类的危害,分析碘泡虫的寄生部位,描述造成的症状,并通过形态学特征对其进行分类研究。随着分子生物学技术的应用,分子鉴定方法为碘泡虫的分类鉴定提供了重要补充,并为碘泡虫的中间宿主生活阶段研究和新种的发现提供了便捷方法。已报道的感染金鱼的碘泡虫种类有异样碘泡虫(M.diversus)[4]、洪湖碘泡虫(M.honghuensis)[5]、晶壳缝碘泡虫(M.lentisuturalis)[6]、卡特碘泡虫(M.cultus)[6]、红河碘泡虫(M.hoabinhensis)[7]、吴李碘泡虫(M.wulii)[8]和关桥碘泡虫(M.gua-nqiaoensis)[9]等。2021年9月,在北京市通州区相邻的两家观赏鱼养殖场发生孢子虫病,感染部位分别为肝胰脏和肌肉。为鉴定病原种类,通过采集样品,利用形态学特征和18S rDNA等方法进行鉴定,明确金鱼所感染的孢子虫种类,旨在丰富金鱼孢子虫病的资料。
1 材料方法
1.1 实验金鱼
2021年9月,取北京市通州区两家相邻观赏鱼养殖场的发病金鱼样品,其中一家金鱼品种名称为鎏金,病鱼头背部呈瘤状隆起,样品编号为BTXD210907;另一家金鱼品种名称为草金鱼,腹部膨大,样品编号为BTXL210907。病鱼体长均约10 cm、体质量约40 g,采样时水温约21 ℃、溶解氧浓度为7.5 mg/L、pH为8.1。
1.2 方法
1.2.1 样品采集和保存
样品(BTXD210907和BTXL210907)金鱼解剖后,肉眼观察各组织白色包囊存在的情况,然后制作鳃丝、肌肉瘤状隆起组织、肝胰脏、肾、脾、性腺等组织的水封片进行孢子虫镜检。观察到孢子虫的样品组织,BTXD210907样品取肌肉瘤状隆起流出液及周边肌肉组织;BTXL210907样品取肝胰脏组织,匀浆后添加95%乙醇进行固定,固定后的样品组织均于-20 ℃保存。
1.2.2 孢子虫形态学观察和形状测量
取95%乙醇固定的样品(BTXD210907和BTXL210907),制作水封片,置于ZEISS AxioLab.A1显微镜下观察孢子虫形态,采用ZEN 2.3图像软件拍照,测量孢子虫长(Spore length,SL)、孢子虫宽(Spore width,SW)、孢子虫厚度(Sporozoite thickness,ST)、极囊长(Polar capsule length,PCL)、极囊宽(Polar capsule width,PCW),以及确定极丝圈数(Polar filament coil,PFC),每个样品测量20个虫体。
1.2.3 孢子虫18S rDNA的克隆与测序
1)DNA提取
分别取95%乙醇固定的样品(BTXD210907和BTXL210907)20 μL,用500 μL超纯水充分冲洗,再以5 000 r/min离心5 min,舍弃上清液,重复3次。采用DNeasy Blood &Tissue Kit (Qiagen,德国) 试剂盒,按照说明书抽提基因组DNA,并置于-20 ℃保存备用。
2)PCR扩增
用于扩增18S rDNA的引物参考Andree K B等[10]设计的碘泡虫属的通用引物For:5’-CTGCGGACGGCTCAGTAAATCAGT-3’、Rev:5’-CCAGGACATCTTAGGGCATCACAGA-3’进行PCR扩增。50 μL PCR反应体系组成:2×Taq PCR Mix 25 μL、25 μmol/L上下游引物各2 μL、模板DNA 2 μL、ddH2O 19 μL。PCR反应条件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 1 min、52 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min,32个循环;72 ℃ 10 min,4 ℃保存。PCR扩增产物经纯化后,送至上海生工生物工程技术公司进行基因序列测定。
1.2.4 系统发育树的构建与分析
将测序样品(BTXD210907和BTXL210907)的18S rDNA基因序列提交至GenBank数据库,获得基因登录号。同时,将两条序列通过NCBI的Blast检索系统进行序列同源性分析,从中选取与所获序列同源性较高的同种虫的18S rDNA基因序列,并从GenBank数据库中获得相关属的18S rDNA序列,利用MEGA 4.0、邻位连接法(Neighbor-joining,NJ)构建系统发育树。通过自举分析进行置信度检测,自举数集1 000次。以武汉单极虫的18S rDNA序列为外源序列。
1.3 数据处理
样品(BTXD210907和BTXL210907)的孢子虫长、宽和极囊长、宽的测量数据以平均值±标准差表示。采用单因素方差分析两样品之间及大、小极囊之间的差异,以P<0.05为显著。
2 结果与分析
2.1 病鱼临床症状
图1
图1
感染孢子虫的金鱼背部隆起（A）、肝胰脏膨大（B）
Fig.1
Showing dorsolateral humps (A) and enlarged hepatopancreas (B) of goldfish infected by Myxobolus spp.
图2
图2
BTXD210907肌肉隆起组织流出液水浸片（400×）
Fig.2
The dorsolateral humps tissue outflow of BTXD210907 smear showing cyst and numerous spores (400×)
图3
图3
BTXL210907 金鱼肝胰脏组织水浸片（400×）
Fig.3
The hepatopancreas tissue of goldfish BTXL210907 smear showing cyst and numerous spores (400×)
2.2 孢子虫形态特征分析
在显微镜下观察样品孢子虫,可见孢子虫壳面观呈梨形,前端略尖,后端钝圆;拥有2个大小略有差异的极囊,位于虫体前端,呈“八”字形排列(图4)。样品BTXD210907的孢子虫平均长为(17.58±0.85)μm、平均宽为(11.02±0.58)μm、平均厚为(8.68±0.42)μm,大极囊平均长为(8.82±0.48)μm、平均宽为(3.88±0.27)μm,小极囊平均长为(8.35±0.48)μm、平均宽为(3.83±0.25)μm,极丝圈数为7~9圈;样品BTXL210907的孢子虫平均长为(18.09±0.54)μm、平均宽为(11.82±0.44)μm、平均厚为(8.82±0.52)μm,大极囊平均长为(8.25±0.16)μm、平均宽为(3.92±0.26)μm,小极囊平均长为(7.95±0.31)μm、平均宽为(3.53±0.26)μm,极丝圈数为7~9圈(表1)。经单因素方差分析两样品的孢子虫在虫体长、虫体宽、极囊长和极囊宽上的差异均不显著(P>0.05),同一样品的大极囊长和宽与小极囊的差异均也不显著(P>0.05)。
图4
图4
孢子虫的形态
注:A为光学显微镜下孢子虫的形态(1 000×);B为单孢子经数码放大的形态。
Fig.4
The morphology of Myxobolus spp.
Notes:A.Spore morphology under a light microscope(1 000×);B.A spore magnified by a digital zoom.
表1 感染金鱼组织的孢子虫形态特征
Tab.1
| 采集地 Location | 宿主 Host | 寄生部位 Site of infection | 孢子长 SL | 孢子宽 SW | 孢子虫厚度 ST | 极囊长 PCL | 极囊宽 PCW | 极丝圈数 PFC |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 北京 Beijing | 金鱼 C.auratus auratus | 肌肉 | 17.58±0.85 | 11.02±0.58 | 8.68±0.42 | 8.82±0.48a 8.35±0.48b | 3.88±0.27a 3.83±0.25b | 7~9 |
| 北京 Beijing | 金鱼 C.auratus auratus | 肝胰脏 | 18.09±0.54 | 11.82±0.44 | 8.82±0.52 | 8.25±0.16a 7.95±0.31b | 3.92±0.26a 3.53±0.26b | 7~9 |
注:a.大极囊;b.小极囊。未标注*的表示差异不显著(P>0.05)。
Notes:a.Large polar capsule;b.Small polar capsule. Unmarked * indicated insignificant differences(P>0.05).The same as
2.3 孢子虫18S rDNA基因分析
将样品(BTXD210907和BTXL210907)测序的孢子虫18S rDNA片段提交至GenBank,获得的登录号分别为OR133488和OR133489。经Blast同源性检索,两株孢子虫18S rDNA 序列与吴李碘泡虫的同源性最高,达99%以上;与塔形碘泡虫(M.pyramidis)的同源性约94%;与洪湖碘泡虫和瓶囊碘泡虫(M.ampullicapsulatus)的同源性约92%。系统发育树也显示,两株孢子虫均与吴李碘泡虫聚为一枝,如图5所示。因此,确认北京市通州区两家相邻观赏鱼养殖场的金鱼发生的孢子虫病的病原为吴李碘泡虫。
图5
图5
基于18S rDNA 部分序列构建的系统发育树(NJ 树)
Fig.5
Phylogenetic tree（NJ tree） based on the 18S rDNA partial sequence of the parasites
3 讨论
3.1 碘泡虫的形态特征与分类鉴定
碘泡虫种类繁多、种间结构相似,孢子虫的形态特征与寄生组织专一性易受到寄生宿主品种不同和环境差异的影响。在没有分子生物学数据佐证的前提下,仅依靠形态学特征、寄生宿主或寄生部位以及发病症状,不足以确诊病原。例如,先前的研究认为寄生于中国金鱼鳃和肝胰脏的吴李碘泡虫、寄生于异育银鲫的关桥碘泡虫以及寄生于日本金鱼鳃的碘泡虫未定种形态特征相同,但因宿主或寄生部位的不同而被定为3个不同的种。随后,2009年Zhang J Y等[9]通过形态特征和分子生物学数据证实三者均为吴李碘泡虫。本研究中寄生于金鱼肌肉的孢子虫和寄生于金鱼肝胰脏的孢子虫与Zhang J Y等[9]报道的吴李碘泡虫的形态特征相似,与日本金鱼(C.auratus auratus)肝胰脏来源株[9]、湖北异育银鲫(C.auratus gibelio)肝胰脏来源株[9]和重庆鲫(C.auratus auratus)鳃来源株[11]在形态度量上存在一定的差异(表2)。因此,还应考虑利用分子生物学技术等分类方法进行佐证[12],必要时分子生物学方法需同时采用多个基因[13]。本研究中,两株孢子虫的18S rDNA序列均与吴李碘泡虫的同源,相似性达99%以上;构建的系统发育树也表明,其与吴李碘泡虫聚为一枝,因此结合形态特征,可以确定这两株孢子虫均为吴李碘泡虫。2019年,杨承忠等[11]通过比较长江流域吴李碘泡虫的三大地理株系,发现各地理株系在形态量度上存在一定的差异,但从分子水平上看,均为种内水平的形态变异,认为吴李碘泡虫的种内形态度量差异可能与地理环境、宿主种类及感染部位有关。本文也验证了这一结论。
表2 吴李碘泡虫不同株的形态学特征
Tab.2
3.2 吴李碘泡虫的寄生部位
已有学者证实吴李碘泡虫可寄生于金鱼的鳃、肝、肝胰脏、脾和腹腔[9]。本次从样品BTXD210907金鱼的背部肌肉检测到吴李碘泡虫,其系统发育树与已报道的肝胰脏寄生株聚为一枝,而鳃寄生株(GenBank登录号为MH920541和MH920542)在另一枝;同时,在该样品的肝胰脏也检测到虫株,而肝胰脏的位置在空间上与头背部肌肉较近。这表明寄生于金鱼肌肉的吴李碘泡虫可能是寄生于其肝胰脏的虫株不断适应进化的结果。结合已报道的吴李碘泡虫在金鱼的寄生部位,进一步说明吴李碘泡虫不具有寄生组织专一性的特点。此外,已有文献报道,碘泡虫属的其他种也可寄生于金鱼肌肉,如Caffara M等[6]发现晶壳缝碘泡虫可寄生于金鱼头背部肌肉并形成瘤状泡; Chinh N N等[7]在野生金鱼的躯干肌肉中检测出红河碘泡虫。但至今未见吴李碘泡虫寄生于鲫或金鱼肌肉的报道,因此本文发现的吴李碘泡虫寄生于金鱼肌肉属首次报道,这丰富了吴李碘泡虫在金鱼寄生部位的数据资料。
4 碘泡虫的防治建议
在碘泡虫防治方面,碘泡虫等黏孢子虫类的体表被有几丁质壳片,药物不易渗透,耐药力很强,因此目前还未发现治疗黏孢子虫病的特效药物。陈昌福等[14]曾分别试验了有效成分为阿苯达唑、地克珠利、敌百虫、盐酸氯苯胍、左旋咪唑、槟榔粉、百部粉和孢虫净等商品药物对异育银鲫黏孢子虫的治疗效果,但没有一种药物对治疗有效。本文采用国家许可水产养殖上使用的地克珠利进行治疗,拌饵用药每月连用7 d,持续半年,并配合及时捞走病鱼等措施,取得较好的效果。高志鹏[15]分别采用桉树油、盐酸氯苯胍、敌百虫、青蒿素、牛至油、百里香酚、香芹酚进行体外杀灭洪湖碘泡虫试验,结果发现桉树油、青蒿素、敌百虫对洪湖碘泡虫的存活率没有影响,盐酸氯苯胍具有一定的杀灭作用,牛至油及其两种主要成分香芹酚和百里香酚都具有较好的杀虫效果,其中以香芹酚杀虫效果最好,这为快速治疗孢子虫病提供了可能。
参考文献
Infection in the fins of the goldfish Carassius auratus caused by Myxobolus diversus (Myxosporea)
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金鱼(Carassius auratus)咽部寄生洪湖碘泡虫(Myxobolus honghuensis)的分子鉴定和系统发育分析
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在福州地区开展金鱼病害监测调查中，发现一种寄生于金鱼（Carassius auratus）咽部的粘孢子虫。为了明确虫株，本文以该粘孢子虫为研究对象，使用18S rDNA和ITS-5.8S基因对其进行分子鉴定及系统发育树的构建和分析。结果表明，虫株形态与洪湖碘泡虫（Myxobolus honghuensis）相似，18S rDNA基因测序结果与已报道的洪湖碘泡虫对应基因序列相似性为98.08%，使用洪湖碘泡虫特异性检测引物可扩增该碘泡虫ITS-5.8S基因片段，结合虫株寄生部位、形态和2个基因的系统发育树分析，可鉴定本文碘泡虫为洪湖碘泡虫。本研究首次发现洪湖碘泡虫除了会危害异育银鲫[C. auratus gibelio (Bloch)]外，还可寄生于金鱼咽部，丰富了对洪湖碘泡虫寄主和寄生部位的认识，对该碘泡虫病害的早期诊断具有一定的参考价值。
The life cycle of Myxobolus lentisuturalis (Myxozoa:Myxobolidae) from goldfish (Carassius auratus auratus),involves a raabeia-type actinospore
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Description of Myxobolus hoabinhensis n.sp.(Myxosporea:Myxobolidae),infecting the trunk muscles of goldfish Carassius auratus (Linnaeus,1758) (Cypriniformes:Cyprinidae) in northern Vietnam
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Six new species of myxosporidia from freshwater fishes in Zhejiang Province
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Utilization of tissue habitats by Myxobolus wulii Landsberg & Lom,1991 in different carp hosts and disease resistance in allogynogenetic gibel carp:redescription of M.wulii from China and Japan
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Relationships among members of the genus Myxobolus(Myxozoa:Bilvalvulidae)based on small subunit ribosomal DNA sequences
[J].Sequences representing approximately 1,700 base pairs of the 18S rRNA gene from 10 different species in the genus Myxobolus were found to group them into 3 clusters that showed little correlation with spore morphology and size or host specificity, criteria currently used for both higher and lower taxonomic placements in the Myxozoa. Of the phenotypic criteria examined, tissue tropism was most correlated with the rRNA groupings observed. Spores of similar size and shape (Myxobolus cerebralis vs. Myxobolus squamalis) were distantly related in some instances, whereas spores with divergent morphology and size were sometimes found to be closely related (M. cerebralis and Myxobolus insidiosus). These initial investigations into the phylogenetic relationships of putative members of the genus Myxobolus clearly indicate the potential limitations of groupings based on size and morphological properties of the spores and host species infected. We propose that 18S rRNA gene sequences, combined with information on tissue tropism, host species infected, and developmental cycles in the fish and alternate host (when and if known) be given greater consideration in taxonomic placements of myxosporeans.
图1
表1
