海带配子体无性繁殖系育苗是一种利用海带配子体将育种和育苗结合起来的新苗种生产方法。这种育苗方法较传统的孢子体育苗方法有以下优点:1)工艺简单,育苗前的配子体培育可在一定规模的器皿中进行,减少了传统育苗需要海上养殖和选择种海带环节。2)配子体育苗避免了大量种菜混合繁殖,减少对品种纯度的影响,能够长期保持品种的优良性状,可在较大程度上解决目前海带品种退化、混杂问题。3)配子体在室内人工条件下培养,可随时根据生产需要进行采苗、育苗,而不受季节的严格限制,同时也避免了种海带养殖中生长发育时常受到不利因素干扰而影响育苗生产的问题。

利用大量的雌、雄配子体进行种苗生产,需解决两个关键的问题:1)配子体克隆的丰富培养问题。即需要找出配子体合适的生长条件,使其具有较高的生长速率,获得足够量的克隆以满足种苗生产的需要;2)配子体发育调控问题。即选择恰当的时机,摸清关键的诱导因素,使配子体从营养生长状态转为发育状态,诱导孢子体的发生。海带配子体与其他生物一样,其生长发育与环境条件有密切的关系。温度、光照、营养盐、溶解气体、接种密度等环境因子直接影响着配子体的生长发育。迄今关于适宜配子体生长和大规模培养的主要条件和技术参数在相关文献中已有报道^[1⇓⇓-4],但目前的研究工作还远不能阐明使克隆从营养生长状态转为发育状态所需的诱导因子和恰当的诱导时机^[5⇓⇓-8]。这是目前制约海带配子体克隆技术在生产中应用的两大问题,也是未来研究的重点和方向。

本研究以“东方7号”海带(Saccharina japonica)配子体为材料,在不同光照周期、温度、氮磷营养盐浓度下,观察雌配子体卵囊形成、排卵及幼孢子体形成过程,探究“东方7号”海带配子体发育的适宜环境条件,旨在为“东方7号”海带配子体人工育苗提供理论依据和数据支持。

以本实验室保存的生长状态良好的海带“东方7号”雌、雄配子体克隆系为实验材料。“东方7号”是全国水产原种和良种审定委员会审定的海带新品种,品种登记号为GS-01-011-2014,该品种是以宽薄型海带种群♀和韩国海带地理种群♂的杂交子代为亲本群体,以藻体宽度等适宜加工性状为选育指标,采用群体选育技术,经连续4代选育而成。在相同栽培条件下,与普通海带品种相比较,其收获期长,叶片宽度提高20.0%以上,淡干产量提高25.0%以上,适宜在中国辽宁和山东沿海栽培^[9]。

取适量的海带雌、雄配子体分别用小型循环泵打碎,300目筛绢过滤,取滤液在显微镜下观察,细胞段长度为100 μm左右。雌、雄配子体悬浊液按照相同的细胞密度以体积2∶1的比例进行混合后,取一定量加入到铺满载玻片的培养皿中,附着24 h后,载玻片上的配子体浓度为显微镜100×视野中20~30个细胞段,即每cm²约有120~150个配子体细胞。将附着后配子体分别放置在不同条件下进行培养,每3~4天更换培养液一次。

以灭菌的天然海水为培养液,设置不同的温度、光照周期和营养盐浓度实验组。

1)温度组。设置5、8、12、15和20 ℃五个温度梯度,其他条件为${\mathrm{N}{\mathrm{O}}_3}^{-}$ -N 4.0 mg/L,$\mathrm{ }{{\mathrm{P}\mathrm{O}}_4}^{3-}$-P 0.4 mg/L,C₆H₅FeO₇-Fe 0.1 mg/L,白光,光强30 μmol photons/(m²·s),光照周期10L∶14D。每个温度梯度组设置3个平行。

2)光照周期组。设置6L∶18D、10L∶14D、12L∶12D、16L∶8D和20L∶4D五个光周期,以连续光照(24L∶0D)作为对照组。其他条件为${{\mathrm{N}\mathrm{O}}_3}^{-}$ -N 4.0 mg/L,$\mathrm{ }{{\mathrm{P}\mathrm{O}}_4}^{3-}$-P 0.4 mg/L,C₆H₅FeO₇-Fe 0.1 mg/L,温度12 ℃,白光,光强30 μmol photons/(m²·s)。每个光周期组设置3个平行。

3)营养盐组。设置6个营养盐(氮、磷)浓度梯度:${{\mathrm{NO}}_3}^{-}$ -N浓度分别为0、0.2、0.4、1.0、2.0、4.0 mg/L,分别以A、B、C、D、E、F表示。其他条件:${{\mathrm{PO}}_4}^{3-}$-P均为0.4 mg/L,温度12 ℃,白光,光强30 μmol photons/(m²·s),光照周期10L∶14D。每个营养盐浓度梯度组设置3个平行。

在显微镜下观察配子体的发育过程,每3天拍照1次,实验周期25 d。

在海带配子体发育成幼孢子体的过程中,雌配子体卵囊形成、排卵和幼孢子体出现时的形态变化明显,易于观察和统计,因此选择发育率即卵囊形成率、排卵率和幼孢子体形成率占总细胞数的百分比作为衡量海带配子体发育的指标。每个培养皿随机观察10个100×视野,分别统计卵囊形成、排卵、幼孢子体和总细胞数,发育率为卵囊形成数、排卵数和孢子体数之和占总细胞数的百分比。

采用双因子方差分析检验不同环境因子和培养时间对配子体发育率的影响,采用相同培养条件和相同培养时间下进行单因子方差分析(One-way ANOVA),并采用Duncan’s方法进行差异显著性分析,用Leven’s-test进行方差齐性检验,必要时进行数据转化。设P<0.05为差异显著,P<0.01为差异极显著。所有统计分析均采用SPSS 24.0软件完成,用Excel软件作图。

方差分析结果显示:不同温度(P<0.001)、培养时间(P<0.001)及两者的相互作用(P<0.001)对海带配子体发育均有显著的影响。图1为雌配子体在不同温度条件下的发育情况。结果表明,在20 ℃时,海带配子体仅营养生长;12 ℃和15 ℃处理组第12天开始出现卵囊和排卵现象,5 ℃和8 ℃处理组第15天才开始出现少量的卵囊和排卵现象。随着培养时间的增长,12 ℃和15 ℃处理组第15天开始出现大量的幼孢子体,第25天发育率达到最大值65%~70%,其中约50%为多细胞幼孢子体,均显著高于5 ℃和8 ℃(图2和表1)。

方差分析结果显示:不同光照周期(P<0.001)、培养时间(P<0.001)及两者的相互作用(P<0.001)对海带配子体发育有显著的影响。图3为雌配子体在不同光照周期条件下的发育情况。结果表明,对照组(24 h全光照)海带配子体均处于营养生长阶段;其他5个光照周期条件下,“东方7号”海带配子体均可进入生殖生长阶段,均出现了卵囊、排卵及幼孢子体。当光周期为16L∶8D和20L∶4D时,该处理第12天开始出现卵囊和排卵现象,且在16L∶8D条件下,出现了幼孢子体,但随着培养时间的延长,总发育率未见明显增加,第25天发育率分别约为28%和13%,显著低于10L∶14D(表2)。其他三组均延在第15天开始出现卵囊、排卵及幼孢子体,其中10L∶14D条件下配子体发育进程及发育率显著高于6L∶18D和12L∶12D(表2),但光照时间较长(12L∶12D、16L∶8D、20L∶4D)的处理组幼孢子体生长速度显著快于光照时间较短的处理组(图4)。

方差分析结果显示:不同氮浓度(P<0.001)、培养时间(P<0.001)及两者的相互作用(P<0.001)对海带配子体发育有显著的影响。图5和图6为雌配子体在不同氮、磷浓度条件下的发育情况。结果表明除无氮组外,其他组均在第12天出现处于卵囊和排卵阶段的配子体细胞,随着有效N浓度的增加,处于发育阶段的细胞所占百分比随之增加。当N浓度≤1.0 mg/L时,配子体发育率均低于50%。当N浓度为2.0 mg/L和4.0 mg/L时,配子体最终发育率均达75%以上,其中孢子体约占70%,显著高于其他组(表3)。

温度、营养盐、光质、光强和光周期等环境因子被认为是调控褐藻配子体生长发育的重要外因,且各种环境因子对海带配子体的生长发育的影响一般存在着交互作用,如皱海带(Laminraria religiosa)配子体发育过程中,在光照适宜和营养盐充足的条件下,温度对配子体的发育影响不显著^[10]。王潇等^[11]研究了环境因子对掌状海带(Laminaria digitata)有性生殖过程的影响,发现温度决定着海带配子体的营养生长和开始发育的时间。目前针对单一环境因子温度、光周期及营养盐等对海带配子体生长发育影响的研究较多。Martins N等^[12]证实,掌状海带配子体生长的最适温度为10~18 ℃, 而发育的最适温度为 5~15 ℃。陈书秀等^[5]研究发现,笼目海带(Kjellmaniella crassifolia Miyabe)配子体20 ℃和25 ℃下均维持在营养生长状态;8~12 ℃大部分配子体(80%~90%)进入生殖生长状态;在5、15 ℃条件下仅有20%~30%配子体细胞进入生殖生长状态,且发育明显滞后于8~12 ℃组。王军等^[13]也发现,利尻海带(L.ochotensis Miyabe)的配子体成熟度在10 ℃条件下最高,在20 ℃条件下,配子体不发育。Schreiber E^[14]发现,糖海带(L.saccharina)配子体生长的最适温度为13~18 ℃,而发育的最适温度为6 ℃。陈书秀等^[15-16]研究了光照周期对笼目海带和多肋藻(Costaria costata)配子体发育的影响,结果表明在15 μmol s^-2s^-1光照强度条件下,较长的光照时间(16L∶8D、20L∶4D)有利于促进笼目海带配子体的生殖生长进程,促进卵囊的形成、受精卵的排放及孢子体的生长,而多肋藻配子体发育率在光照周期12L∶12D时最高。张鑫等^[17]研究了不同光照周期对羊栖菜(Hizikia fusiformis)有性繁殖过程的影响,结果表明长光照周期可以明显促进卵子的排放,延长卵子的存活时间,提高卵子的受精效率,有利于合子的发育与生长。有关氮、磷对海带配子体生长发育的研究均发现适宜的氮磷营养盐有利于配子体生长发育的整个过程^[18-19],鞠青等^[20]认为N∶P>15∶1会降低海带配子体的形成。

本研究根据生产上常用海带品种(系)的配子体发育条件,对“东方7号”海带配子体发育所需温度、光照周期和营养盐浓度进一步优化,通过单因素试验,了解单因素的影响状况,了解其作用显著的范围。根据温度、光周期及营养盐浓度对配子体发育影响的显著性呈依次递进的关系,首先采用单一因子实验得出了最适温度条件,在20 ℃时,海带配子体仅营养生长。12 ℃和15 ℃处理组第12天开始出现卵囊和排卵现象,5 ℃和8 ℃处理组第15天才开始出现少量的卵囊和排卵现象。随着培养时间的延长,12 ℃和15 ℃处理组第15天开始出现大量的幼孢子体,第25天发育率达到最大值约65%~70%,其中约50%为多细胞幼孢子体,均显著高于5 ℃和8 ℃。由此可以看出,12~15 ℃是“东方7号”海带配子体发育的最适温度范围,再结合育苗车间的海水等环境条件,低温更有利于抑制硅藻等的生长,因此选择12 ℃作为光照周期及营养盐浓度实验的温度条件。

光照周期实验结果表明,在16L∶8D和20L∶4D时,海带配子体第12天开始出现卵囊和排卵现象,且16L∶8D条件下,出现了幼孢子体,但随着培养时间的延长,总发育率未见明显增加,第25天发育率分别约为28%和13%,显著低于10L∶14D。其他三组均在第15天开始出现卵囊、排卵及幼孢子体,其中10L∶14D条件下配子体发育进程及发育率显著高于6L∶18D和12L∶12D。由此可以看出,在温度12℃条件下,海带配子体最适发育光周期为10L∶14D。以此为发育条件进行氮磷浓度实验,结果表明添加适量的氮磷是海带配子体生殖生长的必需条件,除无氮组外,其他组均在第12天出现处于卵囊和排卵阶段的配子体细胞,随着有效N浓度的增加,处于发育阶段的细胞所占百分比随之增加。当N浓度≤1.0 mg/L时,配子体发育率均低于50%。当N浓度为2.0、4.0 mg/L时,配子体最终发育率均达75%以上,其中孢子体约占70%,显著高于其他组。

综上所述,采用12 ℃、10L∶14D光照周期、0.4 mg/L P和2.0 mg/L N作为发育条件,可促进“东方7号”海带配子体同步发育,加快发育进程,提高配子体最终发育率,从而提高配子体利用率,减少了育苗所需时间,降低了生产育苗成本,为“东方7号”海带的推广利用提供理论基础。本研究结论也为海带育苗生产过程中进一步降低氮、磷浓度提供了可靠的理论依据。